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临检实验室建设标准与要求、高通量测序(NGS )实验室简介1.1 NGS实验室又叫高通量测序检测实验室。NGS是下一代测序技术(NextGeneration Sequencing)即高通量测序技术的简称。高通量测序技术是 对传统Sanger测序(称为一代测序技术)革命性的改变,可同时对几 十万到几百万条核酸分子进行序列测定,同时高通量测序使得对一个物 种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 也称为深度测序 (DEEP SEQUENCiNG)。1.2由于NGS技术对所检测的核酸模板进行大量扩增,容易出现实验室污 染导致检测结果准确性下降;另外NGS技术要求高、影响因素多,实 验过程处理不当易导致检测结果准确性下降或检测失败。因此临床基因 扩增检验实验室技术验收和规范化管理是NGS技术本身需要,也是在 临床上顺利应用该技术前提。二、NGS实验室临床应用的基本条件2.1必须拥有符合临检中心相关规定的标准NGS实验室。2.2 检测设备必须符合标准 NGS 实验室设置要求:高通量测序仪及配套服 务器;高通量测序检测试剂盒;通用电脑;自动分析软件,实验室样本 信息管理系统等。2.3 检测人员必须通过专门的技能培训,并获得省级以上卫生计生行政部门颁发的临床基因扩增检验技术上岗证书。NGS实验室必须建立严格的 实验室管理制度、建立标准化操作程序(SOP)、建立系列质量管理文 文案大全件等,确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求,确保检测结果准确、 确保实验室卫生安全,确保实验室长期稳定运行。2.4 NGS 临床应用必须在无菌无尘环境下进行操作。三、NGS实验室建设基本要求3.1 主体结构主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金 50 内圆角 铝,从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固,线条简明,美 观大方,密封性好。3.2 标准的各区分隔和气压调节将检测过程分成试剂准备、样本制备、PCR扩增和高通量测序四个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区, 同 时各区通过气压调节,使整个检测实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染 并降低扩增产物对人员和环境的污染。可打开缓冲区和 PCR 扩增区的排风扇往外排气,在实验区的外墙上和各扇 门上都安装有风量可调的回风口,空气通过回风口向室内换气。3.3 消毒在每个实验区和缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯,供消毒用。在各 区还设置移动紫外线灯,对实验桌进行局部消毒。3.4 机械连锁不锈钢传递窗试剂和标本通过机械连锁不锈钢(不建议使用电子连锁方式)传递窗传递, 保证试剂和标本在传递过程中不受污染(人物分流)。3.5 地面地面建议使用PVC卷材地面或自流坪地面,整体性好。便于进行清扫,耐 腐蚀。没有条件的也可采用水磨石地面,或大块的瓷砖(至少800mmx 800mm )接缝需要小于2mm。3.6 照明灯具要选用净化灯具,能达到便于清洗、不积尘的特点。3.7 平面布局NGS 实验室应根据自己的检验项目、所采用的检测技术平台和工作量来决 定分区的多少及各区域的空间大小,至少具体需要多少个区,同样是“个体 化”的,以“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时”作为基本原则。四、各项目实验室建设标准产前筛查与产前诊断(全基因组低拷贝测序技术)图 1:产前筛查与诊断实验室平面图2. 技术流程图标車与文库制备区文库扩堆与檢测区测序区HUrfEm.MrirAiftl CA pcr 眞fit咗宮9t,图 2:产前筛查与诊断技术流程图3. 技术参数分区压力温度相对湿度照明专用走廊OPa20-25X:40%60%主实验室A3OOLX,其余房间200-300LX缓冲区+5Pa试剂准备室+ 15Pa标本与文库制+ 1OPa备区文库扩增与检测区-5Pa测序区-10Pa4. 分区功能4.1 试剂准备室主要功能:在N GS过程中使用到的试剂的配制、分装和保存。4.2 标本与文库制备区主要功能:血液处理、血浆制备、DNA提取、DNA片段化、DNA样品的 纯化、DNA浓度检测、末端修复、接头连接、构建样本的测序文库。4.3 文库扩增与检测区主要功能:文库构建后的 PCR 扩增与纯化、文库浓度检测、文库的混合及混合后的质检分析。4.4 测序区主要功能:测序模板制备(乳液PCR与磁珠富集回收)、上机测序、数据分析、报告审核及发放。5. 仪器配置5.1 试剂准备室主要仪器设备:加样器、冰箱、分析天平、微量台式离心机、涡旋振荡器、 移液器、可移动紫外灯和超净工作台等。5.2 标本与文库制备区主要仪器设备:冷冻离心机、微量台式离心机、掌上三管离心机、涡旋震荡 器、垂直混合仪、移液器、可移动紫外灯、生物安全柜、冰箱、托盘天平、 Qubit 2.0核酸定量仪、电脑(可连接互联网)、条形码打印机、普通打印 机、扫描枪、磁力架等。5.3 文库扩增与检测区主要仪器设备:PCR仪、QPCR仪、Qubit2.0核酸定量仪、可移动紫外灯、 超净工作台、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、UPS、冰箱、移液器、 磁力架等。5.4 测序区主要仪器设备:高通量测序仪、PC电脑、打印机、UPS、恒温金属浴、纯 水仪、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、移液器、超净工作台、可移动 紫外灯、磁力架、PCR仪等。胚胎植入前遗传学诊断(全基因组低拷贝测序)1. 实验室平面图图 3:PGD 实验室平面图2. 技术流程图恋序故上机巧GHM备区4Smri#末嘉童產蒐比文痒检構更podiasMaTO4wuessfijDNAfTfifi文察检側扩 备KFCRJtfi 珠宜黒)搭告度it疾头连棟#轉代图 4:PGD 技术流程图3. 技术参数分区压力温度相对湿度照明专用走廊OPa20-25工40%60%主实验室3OOLX,其余房间 200300LX缓冲区+5Pa试剂准备室+ 15PaWGA制备室+ 10pa扩增一区-5pa标本检测区-10Pa测序区-15Pa电泳区0Pa4. 分区功能4.1 试剂准备室主要功能:在N GS过程中使用到的试剂的配制、分装和保存。4.2 WGA 制备区主要功能:基因组DNA释放、全基因组DNA扩增。4.3 电泳区主要功能:DNA电泳检测及结果反馈、DNA打断等US i曲B启、/ (宝回悭贰)-摄日關州 凶飯B9寸 ofcinw -聲關州 凶BMtxS.寸 會口 垮,2s NQ -摄日關州 凶wfe寸寸畑y权,1 凶期通 OM mus,噩帳IK ,a 艇黃,is fi m第-simw凶做tfCNUS,启勺ffi料4n呱通,-H0w如关U凶蚩鑽s5.4 扩增一区 主要仪器设备:PCR仪、可移动紫外灯、超净工作台、冰箱、微量台式离心 机、涡旋振荡器、UPS、移液器、磁力架等。5.5 文库检测区主要仪器设备:QPCR仪、Qubit2.0核酸定量仪、可移动紫外灯、超净工 作台、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、移液器等。5.6 测序区主要仪器设备:高通量测序仪、PC电脑、打印机、UPS、恒温金属浴、纯 水仪、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、移液器、超净工作台、可移动 紫外灯、磁力架、PCR仪等。遗传病诊断+肿瘤诊断与治疗(杂交捕获测序技术+Sanger测序验证)1. 实验室平面图图 5:肿瘤诊断实验室平面图2. 技术流程图实验流程ii1r亠1阴宜_ gpturedI窑爭IS齧PR1立蛊Ifii尺告洌总图 6:肿瘤诊断技术流程图标本与文库制备区耐MRtr憎与姻t扩増二区扩増一区DZ此瞬知A的片直MR站准备* 彗果分析剔耀 WSrfejft图 7:一代测序实验流程图3. 技术参数分区压力温度相对湿度照明洁净走廊OPa20-25工40%60%主实验室A3OOLX,其余房间200 300LX缓冲区+ 5Pa试剂准备室+ 15Pa标本与文库制备区+ 10PaDNA打断区+ 10Pa4. 分区功能4.1 试剂准备区主要功能:在N GS过程中使用到的试剂的配制、分装和保存。4.2 标本与文库制备区主要功能:样本接收、样本前处理、全基因组DNA提取以及各种样本DNA 或者RNA的提取、DNA片段化、DNA纯化、DNA浓度测定、DNA片段 的末端修复与纯化、接头连接与纯化。4.3 DNA打断区主要功能:DNA打断(片段化)。4.4 电泳区主要功能:片段化DNA电泳检测及结果反馈。4.5 杂交捕获区(扩增一区)主要功能:目的DNA片段的杂交捕获与纯化,Sanger测序目的片段扩增 与纯化、Sanger测序PCR前准备。4.6 文库扩增区(扩增二区)主要功能:杂交捕获后扩增与纯化、文库浓度质检分析、及Sanger测序的PCR 扩增反应与纯化。4.7 测序区主要功能测序模板制备(乳液PCR与磁珠富集回收)、上机测序、及Sanger 测序。5. 仪器配置5.1 试剂准备区主要仪器设备:加样器、冰箱、分析天平、微量台式离心机、涡旋振荡器、 移液器、可移动紫外灯和超净工作台等。5.2 标本与文库制备区主要仪器设备:微量台式离心机、掌上三管离心机、恒温金属浴、移液器、 可移动紫外灯、生物安全柜、冰箱、托盘天平、Qubit 2.0核酸定量仪、PCR 仪、电脑(可连接互联网)、条形码打印机、普通打印机、扫描枪等。5.3 DNA打断区主要仪器设备:Covaris S220超声波打断仪、冰箱、掌式离心机、涡旋振 荡器、移液器、可移动紫外灯等。5.4 电泳区主要仪器设备:电泳仪、微波炉、凝胶成像仪、冰箱、掌式离心机、涡旋振 荡器、移液器、可移动紫外灯等。5.5 杂交捕获区(扩增一区)主要仪器设备:PCR仪、可移动紫外灯、超净工作台、冰箱、微量台式离心 机、涡旋振荡器等。5.6 文库扩增区(扩增二区)主要仪器设备:PCR仪、Qubit 2.0核酸定量仪、微量台式离心机、掌上三 管离心机、涡旋震荡器、移液器、可移动紫外灯、超净工作台、冰箱、磁力 架等。、o5.7 测序区主要仪器设备:高通量测序仪、Sanger测序仪、PC电脑、打印机、UPS、恒温金属浴、纯水仪、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、移液器、超净工作台、可移动紫外灯、磁力架、PCR仪等。
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