地高辛标记探针的Southern印迹方案

地高辛标记探针的DNA印迹方案Southern blot using DIG Prober(分子生物学实验室)Step I采用地高辛高效标记混合物(ROCHE)标记DNA探针1以质粒为模板，PCR扩增序列特异性片段，回收片段，并测定浓度浓度测定：将回收产物取屮稀释5倍，标准分子量的标记物MAKER分别 点1pl , 2pl , 4pl , 6pl然后比较回收产物的条带亮度与MAKER比较后，可以 粗略估算浓度。2取lug模板(第1步扩增回收产物)于1.5ml的eppendorf管中，加入灭菌双蒸 水至终体积为16 u l。3沸水浴处理10min后迅速于冰上冷却使DNA变性(1)摇匀DIG-High Prime (vial 1),取 4pl加入已热变性的模板DNA中， 混匀后，瞬时离心，37C保温20h,65C处理10min终止反应。4取lpl电泳检测，标记后的条带稍大于标记前片断。5标记好的DNA探针-20C保存。Step II基因组DNA酶切1提取高质量的基因组DNA ,浓度 1pg/pl; 测定浓度的方法同测定探针浓度方法一样。2选择合适的内切酶（酶切的DNA量20pg左右。注意考虑到纯化的损失，约30%，酶切DNA浓度过大时，可以考虑多做几管做浓缩）。50pl酶切反应体系:EcoR I (15U/pl )10xM buffer gDNAddH2O5pl5pl10pl(约 10-20pg )up to 50pl注：有些内切酶需加BSA，请参照内切酶说明（包括最适酶切温度）。37C酶切 12h电泳检测），视酶切情况可延长酶切时间，直至酶切完全。65C保温10min停止酶切反应。Step III 预电泳和电泳1配制0.8 %的琼脂糖凝胶（大胶40ml左右，胶薄较好，利于转膜）。2加入适量上样缓冲液（Loading Buffer）点样，点上质粒做对照。注：两边的点样孔尽量空出来点上marker再单独一点样孔用溴酚兰做指示，防止跑过。3 120V， 5min；40V，4h。 溴酚蓝前沿跑至胶边约1 厘米处即可。Step IV 转移胶处理与转膜电泳后用 EB 染色，紫外光下拍照，然后，切下 marker 和右上方一角。1 凝胶在灭菌的双蒸水中漂洗片刻。2.室温下凝胶在0.25M HCI中浸泡15min，吏DNA脱嘌呤，摇床上缓慢摇动，（溴酚蓝由蓝色变为黄色）灭菌的双蒸水中漂洗凝胶。3凝胶转移到10倍于凝胶体积的变性液（1.5M NaCl，0.5M NaOH ）中轻轻 振荡20min ;换液一次，继续漂洗20min。4 灭菌的双蒸水漂洗凝胶片刻，然后置于10倍于凝胶体积的中和液中轻轻振荡20min，换中和液重复一次。换培养皿，用20xSSC转移缓冲液漂洗一下仪器：大培养皿3套换洗过程很重切记清顺序Step V 转膜1将尼龙膜漂浮于超纯水中至完全浸润，转移至20XSSC转移缓冲液中浸泡 15min 。 先尼龙膜再倒水和缓冲液，保证完全浸润。2组装转移装置：玻璃板+滤纸桥（边缘完全充分浸入20XSSC转移缓冲液）+1张 滤纸+凝胶（背面朝上）+尼龙膜（做好标记）+滤纸（3层）+吸水纸+玻璃板+500g 重物（如下图）方向3毛细转移装置如图。在20xSSC转移缓冲液中毛细转移24h，为提高转膜效果可以适当延长时间；转膜期间经常更换吸水纸及加液（注意防止短路！：用封口膜在四周封好，防止膜上吸水纸接触到膜下缓冲液）。4转膜结束后，凝胶拍照检测DNA残留状况。5. 取膜 （用铅笔标记样品孔的位置，切角标示方向）毛细转移法具体步骤：1. 20XSSC浸湿一张whatman 3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一 个“桥”。2. 凝胶反放在浸湿的wha tman 3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。3. 用塑料膜包裹膜的边缘，照凝胶的大小剪一张尼龙膜。4. 膜（20XSCC平衡过）放在凝胶上。5. 尼龙膜上放一张whatman 3mm滤纸、一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.2 0.5kg的物品。6.20XSCC的转移缓冲液中充分转移1824h及时换掉浸湿的吸水纸。Step VI 固定，预杂交，杂交1将尼龙膜浸入6xSSC溶液中25min，除去黏附在膜上的凝胶碎片。2固定：把膜放在两层干燥的吸水纸中央，80C烘烤2h。处理后的膜直接用于杂交或用保鲜膜包裹干燥保存于冰箱。3 配制地高辛杂交液：用 64ml 的无菌超纯水 分两次加入 DIG Easy HybGranules （vial 7）中，迅速于37C振荡5min至溶解。（因为试剂盒中vial7是用大约75ml左右的小瓶装的，原试剂是冻干粉样，配制杂交工作液需加 入64mlddH0,若一次加入会产生大量气泡至溢出，需要先少量加入ddHO,待 其溶解后再加入剩下的部分。）4将事先加入杂交液（DIG Easy Hyb , vial7,10ml/100cm2）的杂交瓶预热至42C,固定好的尼龙膜轻轻卷成圆柱状放入杂交瓶中42C预杂交30min，以