高二生物质疑解惑课件：5-2《多聚酶链式反应扩增DNA片段》（人教版选修I）

欢迎进入生物课堂 课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段 课程标准尝试PCR技术的基本操作和应用 课标解读1 理解PCR技术的基本原理 2 知道PCR技术的基本操作过程 3 讨论PCR技术的应用 1 生物体内DNA分子复制的条件 1 四种是合成子链的原料 2 提供了DNA复制的模板 3 打开了DNA双链 4 催化合成DNA子链 5 使DNA聚合酶能够从开始连接脱氧核苷酸 PCR技术的原理及反应过程 脱氧核苷酸 DNA母链 解旋酶 DNA聚合酶 引物 引物的3 端 2 PCR扩增的原理及条件 1 概念PCR即 是一种迅速的技术 它能以极少量的为模板 在短时间内复制出上百万份的 2 原理 DNA的热变性 在的温度范围内 DNA双螺旋结构解体 双链分开 这个过程称为 当温度缓慢后 两条彼此分离的DNA链又会重新 子链的合成 a 需要 b 合成方向总是从子链的端向端延伸 多聚酶链式反应 体外 扩增DNA片段 DNA DNA拷贝 80 100 变性 降低 结合成双链 引物 5 3 3 条件 模板 分别与模板DNA两条模板链相结合的两种 A T G C四种 耐热DNA聚合酶 一般用 需要一定的和能严格控制的温控设备 DNA 引物 脱氧核苷酸 耐高温的TaqDNA聚合酶 缓冲溶液 温度 3 PCR反应过程PCR一般要经历次循环 每次循环可以分为 和三步 1 当温度上升到以上时 双链DNA解聚为单链 2 温度下降到左右 通过与两条单链DNA结合 3 温度上升到左右 溶液中的四种脱氧核苷酸在的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 三十多 变性 复性 延伸 变性 90 复性 50 两种引物 碱基互补配对 延伸 72 DNA聚合酶 思维激活1 DNA复制缘何必须有引物 提示DNA聚合酶不能从头合成DNA 而只能以3 延伸DNA链 故DNA合成时 必须加入引物 其3 游离 以作为延长DNA子链的 引子 1 细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增的比较 见下表 2 PCR过程 1 变性当温度上升到90 以上时 双链DNA解聚为单链 2 复性温度下降到50 左右 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 3 延伸温度上升到72 左右 溶液中的四种脱氧核苷酸 A T C G 在DNA聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 特别提醒 1 72 左右时 TaqDNA聚合酶有最大活性 可使DNA新链由5 端向3 端延伸 2 DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列 使该段固定长度的序列呈 指数式 扩增 巩固1 标准的PCR过程一般分为变性 复性 延伸三大步 这三大步需要的温度依次是 A 94 55 72 B 72 55 94 C 55 94 72 D 80 55 72 解析当温度上升到90 90 96 以上时 双链DNA解聚为单链 称之为变性 当温度下降到50 40 60 左右时 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 当温度上升到72 70 75 时 溶液中的四种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 称为延伸 答案A 1 实验用具 1 PCR仪 该仪器能自动调控 实现DNA的扩增 如果没有PCR仪 可用3个代替 操作时按程序在3个中PCR反应的微量离心管 2 微量离心管 总容积为 实际上是进行的场所 3 微量移液器 用于 PCR技术的实验操作及评价 温度 恒温水浴锅 水浴锅 来回转移 0 5mL 多聚酶链式反应 转移PCR配方中的液体 2 操作步骤准备 混合 反应 3 操作提示 1 为避免等因素的污染 实验中使用的一些用具在使用前必须进行 2 所用的和应分装成小份 并在储存 3 在中添加反应成分时 每吸取一种试剂后 移液器上的枪头必须 加入组分 设置PCR的循环程序 外源DNA 高压灭菌 缓冲液 酶 20 微量离心管 更换 思维激活2 PCR操作中模板DNA是否需解旋 需要旋转酶吗 提示PCR操作中 模板DNA仍需解旋 但该解旋过程不是DNA解旋酶催化的结果 而是利用DNA热变性的原理 在80 100 温度范围内 DNA双螺旋结构将解体 双链分开 以此达到解旋的目的 1 PCR仪 PCR自动化程度较高 参照下表设计程序即可 将微量离心管放在离心机上 离心约10s 目的是使反应液集中在离心管底部 3 实验中DNA含量的测定DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰 峰值的大小与DNA的含量有关 可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定 具体方法如下 稀释 2 LPCR反应液 加入98 L蒸馏水 即将样品进行50倍稀释 对照调零 以蒸馏水作为空白对照 在波长260nm处 将紫外分光光度计的读数调节至零 测定 取DNA稀释液100 L至比色杯中 测定260nm处的光吸收值 计算 DNA含量 g 50 260nm的读数 稀释倍数特别提醒若没有PCR仪 可进行水浴扩增DNA设置3个恒温水浴锅 温度分别为94 55 和72 在3个水浴锅中依据PCR仪的处理时间来回转移PCR反应的微量离心管即可 巩固2 聚合酶链式反应 PCR技术 是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法 由高温变性 低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期 循环进行 使目的DNA得以迅速扩增 其简要过程如图所示 下列关于PCR技术叙述不正确的是 A PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术B 反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板C PCR技术中以核糖核苷酸为原料 以指数方式扩增D 应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变 解析PCR技术是人工合成DNA的方法 原料是脱氧核苷酸而不是核糖核苷酸 答案C 例1 2011江苏 请回答有关问题 1 利用PCR技术扩增目的基因 其原理与细胞内DNA复制类似 如下图所示 图中引物为单链DNA片段 它是子链合成延伸的基础 PCR技术的原理 从理论上推测 第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 2 设计引物是PCR技术关键步骤之一 某同学设计的两组引物 只标注了部分碱基序列 都不合理 如下图 请分别说明理由 第1组 第2组 3 PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶 下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能 这是因为 思维导图 归纳提升 PCR技术特点 1 PCR不需要解旋酶 而生物体内DNA复制时需要解旋酶 2 PCR需要耐热的DNA聚合酶 而生物体内DNA聚合酶在高温时会变性 3 PCR一般需经三十多次循环 而生物体内DNA复制需要生物体自身的控制 例2 使用PCR仪具体实验操作顺序应为 设计好PCR仪的循环程序 按配方准备好各组分 用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 进行PCR反应 离心使反应液集中在离心管底部A B C D 思维导图 PCR技术实验操作及注意事项 深度剖析PCR反应的操作步骤一般分为准备 包括配制配方及将各配方放于实验台上 移液 混合 离心 反应 因PCR仪是一种自动控制温度的仪器 设计好循环程序就可以进行反应了 答案C 单击此处进入随堂达标检测 教材P631 提示绘图可参考教科书中图5 9 PCR反应中的DNA片段一般以2n的方式积累 其中n为反应循环次数 一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段 2n 230 1073741824 解析PCR扩增DNA片段可以使目的片段呈指数增长 2 提示根据已知DNA序列设计引物 因为PCR扩增的是两种引物之间的特定DNA序列 解析PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的 引物的设计需要丰富的分子生物学实践的经验 同学们 来学校和回家的路上要注意安全 同学们 来学校和回家的路上要注意安全