T-DNA插入鉴定实验报告.doc

T-DNA插入突变体的鉴定 时明辉 同组者：薛敏 学号：201000220069摘要 Ti质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。通过本实验，我们将学习如何用PCR的方法检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。1.引言T-DNA作为一种实验常用的遗传转化方法，在插入突变过程中，插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确定样品是否为T-DNA插入突变纯和体。PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。（PCR基本原理如右图）DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。不同浓度的琼脂糖凝胶对应线状DNA分子分离范围不同。（如下图）2.实验材料试验材料待检测拟南芥植株，我们组选的是18号拟南芥苗；实验试剂液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24:1），无水乙醇，70%的乙醇，TE；引物（Lp、Rp、Bp），反应缓冲液，dNTP，ddH2O，耐热聚合酶；琼脂糖，TAE缓冲溶实验器材离心机，恒温槽，PCR仪，电泳仪，电子天平，冰块；离心管（0.2ml、0.5ml），移液枪等必要的实验器材。3.实验步骤3.1 CTAB法提取DNA（1） 用液氮100mg幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离心管中加入预热至65的600 l 的2CTAB提取液，轻摇混匀。（2） 65水浴30min，其间轻摇混匀。（3） 向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下轻轻混匀10 min，12000 rpm离心15 min，再转移上清液入新管。（4） 向上清液中加入2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-20 下30 min ，12000 rpm离心15 min，弃上清。（5） 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。（6） 将沉淀晾干，加20-50 l TE (pH 8.0)， 65水浴30 min溶解DNA。3.2 PCR步骤：（1）配置反应体系：主要包括DNA模板，引物，反应缓冲液，dNTP，ddH2O，耐热聚合酶。（2）25ul体系：ddH2O 16ul，缓冲溶液2.5ul，镁离子2ul，dNTP 0.5ul，引物1ul，DNA模板2ul，taq酶0.2ul。20ul体系：H2O 13ul，10xTaq buffer（含MgCl2) 2ul，引物LP (10 uM) 1ul，引物RP (10 uM) 1ul，引物BP (10 uM) 1ul，dNTP (各2.5mM) 1ul，模板DNA(30-50ng/l) 1ul，Taq酶(5U/l ) 1ul。（3）配好体系，轻摇混匀，4000rpm离心10秒钟。（4）设定反应程序：1) 预变性：94，5min；2) 循环部分：变性解旋94，40sec；退火53，50sec；延伸72，80sec，循环35次；3) 延伸部分：72，10min；4) 保存：4下可以保存1-2天。3.3琼脂糖凝胶电泳（7） 配置40ml1.2%的琼脂糖凝胶：称取0.489g的琼脂糖放入锥型瓶中，加入40mlTAE加热使其溶解，注意不要使其暴沸；（8） 将加热溶解的琼脂糖凝胶稍冷却，大约到50，将所得溶液移入琼脂糖槽中，使之冷却成型；（9） 将冷却凝固的琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入TAE电极缓冲缓，直到液体稍浸没凝胶；（10） 向所得的25ul PC体系中加入5ul 6loading buffer，轻摇混匀；（11） 以此向点样空中滴加样品，marker DNA滴加约5ul，其他的样品，每个点样空滴加15ul（TSP法提取样品由于量很少，只加了10ul）；（12） 点样完成后，加上110v电压，凝胶电泳大约30-40分钟，直到DNA大概跑到凝胶的三分之二处；（13） 取出凝胶，放入EB（溴化乙锭，强突变剂，剧毒慎碰）染液中染色10-15分钟；（14） 之后放入凝胶成像仪中，观察DNA电泳的情况。4.结果 图一为CTAB法提取的一组18号拟南芥DNA，其中号的引物为LP和RP，号管是BP和RP，号管是三引物PCR后电泳的结果；是使用TSP法提取的一组18号拟南芥DNA，由于提取结果不好，这里就不多介绍了。号为Marker DL2000。由上图所示，号泳道以LP和RP为引物PCR出的没有线性带；号泳道以BP和RP为引物PCR出的只有一条7501000bp大的条带，目测约为850bp；号泳道也有一条约为850bp的线性带，但是850bp的带上面还有一条，看不清楚的带，约为1100bp大小。由此，我们组的实验结果不是很理想，不能判断TiDNA插入情况。所以，我们又做一次PCR和电泳，结果如下图所示。 1 2 3 4 5图二本次实验，我们采取了20ul系统，考虑到上次结果，我们的三引物PCR电泳结果多出了一条带，分析我们可能是插入的杂合突变体，这次对LP和RP为引物的电泳做了两个。来验证LP、RP组是否是真的没有大片段。如上图所示：1、5号泳道是marker DL2000，2、3、4号泳道分别是以LP、RP引物PCR电泳结果，以BP、RP引物PCR电泳结果，以LP、RP引物PCR电泳的结果。可以看出，只有三引物的PCR电泳出来的结果有一条大片段。5.分析：DL2000 Marker电泳分析中各条带分布情况（如左图）：5.1结果分析各插入类型理论组合插入类型野生型杂合突变型纯和突变型片段大小LP、RP：大大无BP、RP：小中等中等LP、RP、BP：大、小大、中等中等如电泳图所示结果所示，本次实验是比较成功的。DNA Marker的选取上也比较合适：各长度的Marker分布比较均匀，能比较精确的从Marker电泳条带之间读出电泳结果；从DNA电泳距离看，图一显示第一次电泳结果不是很好： 100bp左右的非特异性带非常接近凝胶边缘快要跑出，但目标带所在位置在Marker条带之间1/2到2/3处，比较适合观察。根据图一、图二所示结果，以2个电泳道的LP、RP为引物的PCR电泳结果没有大片段，只有100bp大小片段，因此可以排除图一中3引物PCR电泳出现的大片段结果，推断图一中泳道的大片段为850bp的大片段的拖尾，所以，我们组选的18号拟南芥是纯和突变体。5.2实验分析5.2.1加液氮碾磨叶片时，最好保持离心管中始终有液体氮存在，如果碾磨一段时间后中途要加液氮继续碾磨，一定注意，液氮沸腾时极易将已经碾磨好的叶片吹走；另一点，碾磨时要迅速，避免空气中的水汽在离心管上凝结。5.2.2 DNA有一定的物理脆性，所以在提取过程中混匀时一定要缓慢的摇晃，切忌剧烈震荡。5.2.3加液氮碾磨时，注意不要将叶片挤到离心管的底部，那样会导致碾磨不充分。5.2.4在碾磨时，注意观察离心管内叶片的情况，直到叶片呈现翠绿色的粉末即表示碾磨充分。5.2.5 DNA模板中蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应；模板降解会导致PCR扩增无产物；模板加量过多也会导致非特异性扩增增加。引物的长度要适当、避免二级结构和二聚体；避免反复冻融；浓度适当,过高导致非特异性增加,过低则无扩增产物。Mg2+浓度过高，非特异性增强，过低无扩增产物。5.2.6 PCR中所需的各种试剂都应避免污染，而且尽量减少冻融的次数。5.2.7电泳电压的确定一般是按照5V/cm来确定，此次实验中所有电泳槽长约20cm，计算的电压为100V，但是根据第一次实验结果看，30min、100V电压的电泳，DNA跑胶距离不够，所以为了提高实验速度，在DNA承受范围内，将电压提高到110V。5.2.8再次强调EB（溴乙锭）是一种荧光染料，能嵌入到双链核酸碱基对平面之间，250310 nm波长的紫外光激发下发出橙红色光，常用于检测核酸分子。因此它也是一种强诱变剂，有致癌作用。染色时一定做好防护。6.拓展讨论：拟南芥作为高等植物研究的模式植物的理由：拟南芥命周期短，仅有一个月；这种杂草状的十字花科植物，在所有植物中基因组率先被完整破译.拟南芥只有五对染色体，基因组较小；基因操作方便。培养条件：气候室生长，温度18-22C，空气湿度70%-80%，光照强度300mol/sm2 。参考文献1.山东大学遗传学实验ppt2.T-DNA插入突变及其研究进展/王凤华、李光远/河南科技大学