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第一章 微生物与工业微生物学 第节 微生物概述、微生物的发现 当人们在非洲南部发现了杆菌的化石之后, 才知道在大约迄今35亿年以前, 微生物(microorganism, microbe)就已经出现在地球上了。那时, 整个地球还是微生物独霸的一统天下。可见微生物的“资历”在所有生物中是最古老的。人类在地球上已经和微生物相处了几十万年。 但是, 由于微生物个体过于微小, 人的眼力不够，又缺乏观察手段, 对微生物世界缺乏认识, 长期处于一种无知的状态，因而对始终团团包围在人体内外的微生物却“视而不见, 触而不觉”,甚至于广得其益而不感其可亲, 深受其害而不知其可憎。实际上, 由于微生物群体外貌的隐约显现，以及微生物所造成的食物发霉、腐败等现象，人类已经猜想并感觉到除动植物外，还有一类微小生物的存在。人们甚至已经在不知不觉中利用了它们的活动。 如我国劳动人民在长年累月的生活和生产实践中，就已经渐渐地积累了防止食物腐败和预防传染病的方法, 甚至很早就已经学会了应用微生物的自然发酵作用酿酒制醋了。图1 1 微生物学的先驱者列文虎克人类第一次真正认识到微生物的存在, 还只是距今300多年前的事。那是在1676年, 荷兰一位名叫安东列文虎克 (Antony van Leeuwenhoek) 的业余博物学家(图1 1), 将磨好的玻璃制成透镜片，叠夹在两块金属板中间, 自制成放大率为50270倍的各种简单显微镜 (图1 2), 用它来观察并描述了啤酒中的小球状体(酵母菌), 观察了污水、牙垢、唾液和食醋中的“微动体”，看见了原生动物和细菌。列文虎克首次向世人揭示了一个崭新的微生物世界, 为微生物的存在提供了有力的证据，因而成为世界上第一位最先看到微生物个体形态的微生物学先驱者。ABCD 图1 2 列文虎克自制的简单显微镜 A透镜 B标本支架 C聚焦旋钮 D升降旋钮到了19世纪，微生物的存在进步被人们的实验研究结果所证实。如1837年，德国生物学家Schwann用显微镜观察了正在发酵的葡萄汁，见到增殖的圆形酵母，并发现葡萄汁中产生了CO2； 1838年,法国Tour报道了他使用300400倍显微镜和测微尺测出了啤酒酵母的直径在10m以下, 并观察到酵母通过发芽产生子细胞, 总细胞数可增加七倍； 1861年, 法国科学家Louis Pasteur使大量空气通过特制棉层，再把阻留在棉层上的附着物移到玻璃片上用显微镜观察。结果发现空气中也存在着大量的游离微生物。他又在长颈烧瓶实验中证明了发酵和腐败都是由微生物引起的，还能在发酵工厂现场用显微镜分辩出发酵菌和杂菌。二、微生物的定义及成员微生物一词不是生物分类学上的专用名词，而是所有用肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。微生物的个体非常微小，小到必须用微米（m）级甚至要用纳米（m）作为计量单位。如空气、水和土壤中就存在着大量的各种各样微生物，由于我们这双肉眼眼力不够，无法直接看到它们的存在，必须借助于光学显微镜或电子显微镜, 把它们放大几百、上千甚至上万倍才能看清其真面目。细胞是组成生命有机体基本的结构单位和功能单位，高等生物的个体是由许许多多的细胞所组成的, 如人体约由1800万亿个细胞组成。微生物的个体结构却非常简单, 大多数微生物是单细胞生物, 即一个细胞就是一个可以独立生活的微生物个体。少数微生物是多细胞, 还有一些微生物甚至连一个细胞都不是, 只是由蛋白质和(或)核酸组成的不能独立生活的大分子生物。显然, 它们是一群地球上最低等的生物。综上所述, 如果要给微生物下一个比较恰切的定义, 则可以表述为：微生物是指所有形体微小，单细胞或结构简单的多细胞，或没有细胞结构的一群最低等的生物。整个微生物家族的成员包括三大类：非细胞类微生物、原核细胞类微生物、真核细胞类微生物。现分述如下：(一)非细胞类微生物1.真病毒 真病毒 (euvirus) 以活细胞内专性寄生(感染态)或以无生命的生物大分子(非感染态)两种形式存在, 由核酸和蛋白质组成的超显微的非细胞生物。 如人类病毒有：流感病毒、肝炎病毒、艾滋病毒(HIV)等；动物病毒有：腺病毒、鸡瘟病毒、口蹄疫病毒等；植物病毒有：烟草花叶病毒、番茄丛矮病毒等；原核生物病毒有：噬菌体。2.亚病毒 亚病毒 (subvirus) 只含核酸和蛋白质两种组分的其中一种的生物大分子病原体。包括类病毒(只含RNA, 专性活细胞内寄生)、拟病毒(仅由裸露核酸组成, 包裹于真病毒粒中)、朊粒(不含核酸的传染性蛋白质微粒)等。(二)原核细胞类微生物1.细菌 细菌 (bacteria) 是结构简单的单细胞原核生物，一般要在普通光学显微镜下放大千倍以上并染色才能清楚看见其个体。如人体肠道内的大肠杆菌、粪链球菌；用于酿醋的醋酸杆菌；使牛奶变酸的乳酸杆菌；生产味精的谷氨酸短杆菌；生产淀粉酶的枯草芽孢杆菌等。2.放线菌 放线菌 (actinomycetes)呈丝状生长，营养菌丝为单细胞, 以孢子繁殖的一类原核生物,一般要采用油镜观察。如生产链霉素的灰色链霉菌，生产红霉素的红色链霉菌，生产庆大霉素的棘孢小单胞菌等。3.蓝细菌 蓝细菌 (cyanobacteria)旧称蓝藻或蓝绿藻。呈单细胞、非丝状群体或丝状体的大型原核生物，能进行产氧光合作用。如发菜念珠蓝细菌，盘状螺旋蓝细菌(螺旋藻)等。4.支原体 支原体 (mycoplasma) 是一类不具细胞壁的最小型原核生物, 能在营养丰富的培养基上独立生活, 许多种类是致病菌。如肺炎支原体、生殖道支原体等。5.立克次氏体立克次氏体 (rickettsia) 具有细胞壁的较大原核生物, 不能独立生活, 专性寄生于真核细胞内，是某些人类传染病的病原体。如斑疹伤寒立克次氏体、恙虫热立克次氏体等。6.衣原体衣原体 (chlamydia) 的细胞壁缺肽聚糖, 缺乏产能酶系的原核生物，于真核细胞内营专性能量寄生的一类病原体。如沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体等。(三)真核细胞类微生物1.酵母菌 酵母菌 (yeast) 是单细胞真菌, 能发酵糖类，是一类最低等的真核生物。般用高倍镜（400600倍）观察其个体细胞形态。如用于面包制作的面包酵母、酒精和酒类生产用的酿酒酵母、石油制品脱蜡用的假丝酵母等。2.霉菌 霉菌 (mould, mold) 是引起物品霉变的丝状真菌, 单细胞或多细胞真核生物。可用低倍或高倍镜观察其个体形态。如酿制小曲酒的根霉菌, 制造豆腐乳的毛霉菌, 生产葡萄糖的曲霉菌, 生产青霉素的青霉菌等。3.蕈菌蕈菌 (mushroom) 又名伞菌或担子菌，能产生大型肉质子实体的真菌。如蘑菇、香菇、草菇、平菇、木耳、银耳、竹荪等食用菌以及灵芝、云芝、猴头等药用菌。4.藻类 藻类 (algae) 是单细胞或单细胞的聚合体，进行光合作用并产生氧气的一类真核生物。如微星鼓藻、团藻、栅藻等。5.原生动物 原生动物 (protozoan) 个体微小，无真正细胞壁，具运动性，行吞噬营养的单细胞真核生物。如阿米巴、纤毛虫、鞭毛虫等。可见微生物世界中的成员确实是阵容庞大，姿态万千，芸芸众生，各有特色。以上三大类微生物中, 原核生物中的细菌、放线菌，真核生物中的酵母菌、霉菌和蕈菌,以及非细胞生物中的噬菌体, 是在工业上有重要用途或关系密切的微生物, 因而是本书讨论的重点。为了对微生物有更多的了解，下面将对其特性作一概述。 三、微生物的特性我们知道，物体的体积越小，其比面值 (surface to volume ratio) （K=表面积/体积）就越大。例如鸡蛋、豌豆和原生动物 (直径150m) 的比面值K分别约为1.5、6和400。由于微生物的个体极其微小、因而其比面值极大。例如一个直径为1m的球菌, 其比面值K竟达到60000。这就使形体极其微小因而具有小体积大面积这一突出特点的微生物, 除了具有一般大型生物的共性外, 还带来了以下这些任何其它生物所不能比拟的特性。(一)种类多到目前为止, 人们已经发现并已认识的微生物种类大约有20万种, 其中绝大多数为较容易观察和培养的真菌、藻类和原生动物等大型微生物。但是, 正如一位前苏联微生物学家所说的, “目前我们所了解的微生物种类, 最多也不超过生活在自然界中的微生物总数的10%”。 据粗略估计, 微生物的种类约为几百万种。人类已经开发利用的微生物则仅占已发现微生物种的约1%, 都是与人类的生活、生产关系最密切的那些种类。此外，在现有环境中还存在着极其大量的“不可培养的”（unculturable）微生物。随着人们对微生物世界研究的不断深入, 对微生物分离纯化和培养方法的不断改进, 大量新的微生物种属, 将会源源不断地补充入人类为微生物所编造的“花名册”中。以真菌为例，每年所发现的新种就有上千个。微生物种类多, 一方面还表现在微生物的生理代谢类型多。不同种类的微生物, 由于具有各自不同的酶系, 因而能分解利用地球上各种不同的有机物质(包括有毒物质), 具有各自不同的生活习性 (如嗜温、嗜热、嗜酸、嗜盐、耐高渗等)、不同的代谢方式 (如生物合成、生物转化、生物固氮等) 和不同的产能方式 (如光能自养型和异养型、化能自养型和异养型)。微生物真可谓嗜好千差万别, 各尽所能, 各取所需。人类可利用微生物的这种机能来转化各种初级有机物质, 变废为宝, 防治公害, 保护环境。微生物种类多, 另一方面还表现在微生物能产生和积累的代谢产物种类繁多。据报道, 仅微生物产生的次级代谢产物就有万多种。人们已知道的微生物代谢产物就大类而言, 主要包括：酶类、多肽蛋白质类、抗生素类、核苷酸类、氨基酸类、有机酸类、糖类、酯类、醇酮醛类、激素类、毒素类等, 每一大类的代谢产物又往往有成百上千种。例如, 单从各种微生物中己发现的限制性核酸内切酶就有约1500种；已发现的仅来自微生物的抗生素就有约5000种；一个宽1m长几m的小小大肠杆菌就可以产生出2000多种不同的蛋白质。微生物能产生和积累各种各样代谢产物的这种特性, 正好可被人类采用生物合成技术来生产各种有用的发酵产品。(二)分布广微生物因其形体微小、重量轻, 故可以随着风和水流到处传播。在空气、水、土壤和动植物体表体内, 到处都充满了大量的各种微生物。例如曾测得1立方米的空气中就有几万个微生物, 1毫升港口海水就有十几万个微生物, 1克肥沃土壤竟有几亿到几十亿个微生物, 一个成年人体内所携带的微生物总重量约为1 kg, 人的粪便中约有三分之一是微生物的菌体。可以说微生物是无处不有, 无孔不入, 几乎到处都是微生物活动的场所。只要环境条件合适, 它们就可以在那里大量地繁殖起来。凡是有动植物生存的地方都有微生物存在, 而没有动植物生存的地方也有微生物存在。因为一部分微生物具有特殊的抗逆性, 它们可以在某些恶劣的极端环境条件下生活, 被人们认为是生物圈上下限的开拓者和各种世界记录的保持者。无论在几百米的深土, 万米的深海, 还是几万米的高空, 无论是在热气腾腾的温泉, 还是在零下负几十度的极地, 无论是在高酸度的有色金属浸矿水, 还是在高浓度的盐湖水, 都发现有微生物家族成员的踪迹。例如, 曾报道前苏联科学家在南极进行钻探时, 发现深度达三百米的岩心中也有活细菌存在；美国科学家在东太平洋深度达1万米的海底温泉中, 发现大量耐高温高压的硫细菌；人们用火箭曾从8万米的高空中采集到微生物。由此可见, 微生物是在地球上占有最多领土、领海和领空的一群生物。(三)繁殖快微生物惊人的生长繁殖速度是其它任何生物都望尘莫及的。若以体重增加一倍的时间计算, 小牛约需五六十天, 小猪约需三四十天, 小鸡约需一二十天, 野草也需十几天, 而生长速度最慢的微生物只需十几小时就足够了。一般细菌的世代时间为几十分钟至一百多分钟。在最适宜的培养条件下, 人们最熟悉的大肠杆菌每1320分钟就可分裂出新的一代。一个多小时就“五世同堂”了。若按每20分钟分裂一次计, 一天就可分裂72次, 一个细菌经一天繁殖后, 总细菌数可达271个 (重约4千多吨), 若再继续繁殖下去将不可思议。 当然, 这只是理论上的推算, 而实际上, 尽管由人为创造的最适培养条件, 也只能维持数小时, 细菌不可能无限制地进行指数分裂。微生物繁殖速度快这一特性, 在发酵工业上有着重要的实践意义。人们只需在常温常压及近中性的pH条件下, 利用简单的营养物质就可以繁殖生产出大量菌体蛋白质, 此外, 由于微生物繁殖速度快, 代谢产物积累就迅速, 因而发酵周期短, 生产效率高, 在短时间内就可以获取大量有用的发酵产品。(四)代谢强微生物的代谢强度比起高等生物要高出几百至几万倍。例如，一种称为产朊假丝酵母的酵母菌，其合成蛋白质的能力比大豆植株要强几百倍, 而比肉用公牛要强好几万倍。微生物代谢能力强主要表现在吸收多，转化快。吸收多即“胃口大”。例如，一个能够利用乳糖的细菌每小时能消耗（分解）的乳糖量等于其自身细胞重量的2千倍以上；转化快即“工作效率高”。例如，1公斤的酵母菌在一天之内可使几吨糖全部转化为酒精和二氧化碳；一接种环的谷氨酸生产菌，经两天的扩大培养和发酵就能将8吨糖和2吨尿素转化为3吨菌体和4吨谷氨酸。可见，微生物细胞确实是一个生产效率极高的“活工厂”。微生物代谢能力强这个特性, 为它们的高速生长繁殖和产生大量代谢产物提供了充足的物质基础。其代谢能力强的主要原因是由于个体小，比表面积大，因此它们能够在细胞与环境之间迅速交换营养物质和代谢产物。同时，它们在细胞内也会不断合成具有高活性的代谢酶类以适应自身迅速生长繁殖的需要。(五)易变异微生物容易发生变异的主要原因, 是个体多为单细胞或结构简单的多细胞，甚至非细胞结构。因而在受到外界物理或化学因素影响后，很容易引起细胞内的遗传物质发生突变，结果导致遗传性状，包括形态或生理表型上的变异。微生物易变异的另一个原因是细胞增殖速度快，细胞数量多，因而尽管其自发突变率很低，也会造成在短时间内产生较多的变异后代。很显然，微生物容易变异的特性对人类而言既有益又有害。一方面，人们可以采用各种物理的化学的诱变因素对微生物群体进行诱变处理，然后再用适当的方法筛选出正突变菌株，从而提高或增加菌株的某种性能。而这种诱变育种过程往往可在短时间内就能进行和实现的。如用于生产青霉素的产黄青霉菌, 开始筛选获得时，每毫升发酵液仅含约20单位的青霉素, 但经过多次诱变选育后，每毫升已超过5万单位了。另一方面，工业生产中应用的优良生产菌种，如果使用或保存不妥，也很容易发生负突变，使产量大大降低甚至于不再积累某种产物。更为严重的是病原微生物对人类医疗上使用的某些抗生素产生了耐药性变异，使抑菌的用药浓度不断提高。例如40年代初至今，成人患者的青霉素注射剂量, 已由每天10万单位提高到100万单位甚至上千万单位。有的青霉素耐药变异菌株，其耐药性竞比原始菌株提高了1万倍。这使原本已得到控制的相应传染病变得无药可治。以上微生物的五个特性是所有微生物的共性，对人类来说是既有利又有弊的，我们学习工业微生物学的目的就在于兴利除弊。对于大部分有益的微生物，我们要利用这些特性为人类造福，但对于腐败微生物或少数病原微生物，我们则要设法控制这些特性，以减少它们的破坏性和危害性。 四、微生物的分类、鉴定和命名微生物分类学是研究微生物分类理论和技术方法的一门科学, 对于我们认识、研究和利用各种微生物资源十分重要。微生物分类学的内容包括分类、鉴定和命名三个部分。分类是根据微生物表型特征的相似性或系统发育的相关性进行分群归类, 编排成系统；鉴定是依据现有的微生物分类系统, 通过各种特征描述和测试, 确定一个未知名微生物所应归属分类群的过程；命名则是根据国际统一命名法则, 给予每个新发现的微生物一个特有的专用名称, 即学名。(一)微生物的分类单位在微生物分类学中，将具有相同特征的微生物构成同一个种（species）；将性质相似、相互有关的各个种组成属（genus）；相近似的属合并为科（family）；近似的科合并为目（order）；近似的目归纳为纲（class）；综合各纲成为门（phylum）；由若干门组成界（kingdom），门、界水平之上构成域 (domain)。由此构成一个完整的国际公认的分类单位等级。因此，微生物种以上的分类单位自上而下依次分为域、界、门、纲、目、科、属、种共8级，这是主要的分类单位。此外，在两个主要分类单位之间，还可添加亚门、亚纲、亚目、亚科、亚属、亚种等次要分类单位。在细菌分类中, 还可在科和属之间增加族和亚族等分类单位。此外，在亚种以下常用培养物、菌株、居群和型等非正式的分类群名称。下面分别简单介绍微生物一些常用的类群名称。菌株（strain）：从自然界中经分离得到的任何一种微生物的纯分离物, 或在实验室中任何由一个独立分离的单细胞繁殖而成的纯培养物均可称为某菌种的一个菌株。菌株是微生物学实验中最基础最常用的操作实体。种：可以认为是表型特征十分相似、亲缘关系极其接近的一群菌株的总称 (可用一个典型菌株作为该种的模式种)。种是微生物最基本的分类单位。亚种（subspecies）：一般是指其某一明显而稳定的变异特性与模式种不同的种。亚种是正式分类单位中最低的等级。变种（variety）则是亚种的同义词。属：是指具有某些共同特征或密切相关的一群微生物种的总称。属是微生物的基本分类单位, 属与属之间的差异比较明显。(二)微生物的命名微生物与其他生物一样，按国际命名法规命名，即采用双名法或三名法，给每一种微生物取一个国际学术界都公认的科学名称，即学名(scientific name)。每一个微生物的学名均由拉丁词、希腊词或拉丁化的外来词组成，在出版物中应排成斜体字。在一般书刊中用双名法 (binominal nomenclature) 表示一个微生物种的学名时, 学名由一个属名和一个种名组成。属名在前，是一个表示该种微生物主要特征的名词，首字母应大写；种名在后，是一个描述微生物次要特征的形容词或名词，首字母小写。例如大肠埃希氏菌的学名为：Escherichia coli；巴斯德酵母的学名为：Saccharomyces pastori；黑曲霉的学名为：Aspergillus niger。有时在种名之后附有定名人的姓（用正体，可省略），例如Rosenbach定名的金黄色葡萄球菌：Staphylococcus aureus Rosenbach。当某一种微生物是个亚种或变种时, 其学名则采用三名法 (trinominal nomenclature) 表示, 即学名 = 属名 + 种名 + 亚种或变种的加词。例如枯草芽孢杆菌黑色亚种的学名应写成：Bacillus subtilis (subsp.) niger；酿酒酵母椭圆变种的学名应写成： Saccharomyces cerevisiae (var.) ellipsoideus。subsp. 或var.一般可省略掉。如果是新种则在学名之后加nov sp.；有时只泛指某一属的微生物，而不指定某个具体种或没有种名只有属名时可在属名后加正体sp. (单数)或正体spp.(复数)；有时微生物也采用通俗或简化的名字，即俗名，具有简明和大众化的优点。如丙酮丁醇梭状芽孢杆菌称为“丙丁菌”，铜绿色假单胞菌称为“绿脓杆菌”，金黄色葡萄球菌称为“金葡菌”等。菌株的名称可随意地用字母、符号或编号等表示，都放在学名后面。例如 Baccillus subti-lis BF7658 和 Baccillus subtilis AS1.398是工业上应用的枯草芽孢杆菌的两个菌株。(三)微生物在生物分类系统中的地位 近一百多年来人类对生物分类从两界系统经历了三、四、五和六界系统。微生物在所有界级分类系统中, 都占有最宽广的领域, 占据了绝大多数的“席位”。若按1977年我国学者王大耜等在魏塔克（R. H. Whittaker）主张五界系统的基础上再增加一个病毒界而形成的六界系统，那么微生物在该分类系统中应分别属于病毒界、原核生物界、真核原生生物界和真菌界，如下表所示：动物界 植物界 蕈 菌 真菌门 霉 菌 真菌界 酵母菌 粘菌门 粘菌 原生动物 生物分类系统 真核原生生物界 微 生 物 单细胞藻类 蓝色光合菌门 蓝细菌 原核生物界 放线菌 细菌门 细 菌病毒界 病毒（噬菌体）1978年, 美国伊利诺斯大学的C. R. Woese等人, 又提出了三域学说 (three domains theory) 这个新的界级分类系统。该学说是在对大量微生物和其他生物进行16S和18S rRNA测序并比较其同源性水平后提出的。三域 (又称三原界)是指真细菌域、古生菌域和真核生物域。在这里古生菌域是新建立的一类原核生物, 都是一些能在极端环境条件下生存的嗜极菌。原核生物也被分成两个有明显区别的域, 并与真核生物一起构成整个生物界的三个域。三域学说认为, 一切生物原来都由一种共同的祖先, 即一种小细胞进化而来。这种小细胞先分化出细菌和古生菌, 后来在古生菌分支上的细胞, 吞噬了朊细菌和蓝细菌并发生了内共生, 朊细菌和蓝细菌再进化成宿主细胞中的细胞器, 即线粒体和叶绿体, 宿主最终发展成了各类真核生物。目前, 三域学说已获国际学术界的基本肯定。 图1 3是Olsen和Woese提出的 “全生命系统树”，描画出地球上所有生命由共同祖先沿着三个谱系进化的大致轮廓。图1 3 全生命系统树(四)微生物的分类鉴定依据微生物的分类是以它们的形态结构、生理生化反应和遗传性等特征的异同为依据，根据生物进化的规律，将微生物进行分门别类，并根据相似性或相关性水平编排成系统。微生物分类鉴定的主要依据包括：1. 经典的分类鉴定依据(1) 微生物的形态特征：包括个体形态 (细胞形态、大小、排列、运动性、特殊构造、染色反应等), 群体形态 (菌苔形态、菌落形态、在半固体及液体培养基中群体的生长状态等)。(2) 微生物的生理生化特性：包括对能源、碳源、氮源及生长因子等营养的要求, 对生长温度、溶氧、pH、渗透压等环境条件的要求，代谢产物的种类、产量、颜色和显色反应, 产酶的种类和酶反应特性, 对药物的敏感性等。(3) 微生物的生态特性：包括在自然界的分布情况，与其他生物有否寄生或共生关系, 宿主种类及与宿主关系, 有性生殖情况, 生活史等。(4) 血清学反应：常借助特异性的血清学反应来确定未知菌种、亚种或菌株。2. 现代的分类鉴定依据(1) 细胞壁的化学成分 根据不同细菌和放线菌的细胞壁组成分和结构具有明显特殊性，通过细胞壁的化学成分分析, 可作为分类的依据, 对菌种鉴定有一定的作用。(2) 细胞的其他化学成分 分析某些原核生物的全细胞水解液糖型、磷酸类脂成分、枝菌酸、醌类等成分，在菌种分类鉴定上有一定的价值。(3) DNA碱基比例 (GC比) 各类微生物GC比的范围不同, 亲缘关系相近的种, 其基因组的碱基序列相近, GC比也接近；亲缘关系较远的种, GC比差距也较大。可以此作为鉴定微生物新种时的重要指标。(4) DNA杂交率 亲缘关系越接近的微生物, 其DNA碱基序列也越接近。将不同微生物来源的DNA热变性为单链，再进行重新配对杂合，通过测定其杂交率，可判定微生物的亲缘关系, 从而作出更精确的分类。它是比上述GC比更精确的遗传性状指标, 对有争议的种的界定和新种的确定有重要作用。(5) rRNA寡核昔酸序列同源性 选用细胞中最稳定的16S rRNA或18S rRNA, 用RNA酶水解使之产生一系列寡核昔酸片段。若两种微生物的亲缘关系越近, 则其所产生的寡核昔酸片段的序列也越接近。通过分析寡核昔酸序列同源性程度, 可确定不同微生物间的亲缘关系和进化谱系。(6) 微生物全基因组序列 DNA是除少数RNA病毒以外的一切微生物的遗传信息载体。各种微生物都有其自身独特而稳定的基因组DNA序列, 不同菌种间基因组序列的差异程度, 代表着它们之间亲缘关系的疏密。因此, 对那些与人类健康、生活和生产关系重大的微生物, 进行全基因组DNA序列测定, 是当前生物科学领域中掌握某微生物全部遗传信息的最佳途径, 也是微生物现代分类鉴定中更细致和更精确的遗传性状指标。应该指出的是不同种类微生物应采用不同的重点鉴定指标。例如, 鉴定丝状真菌和大型真菌时, 常以其形态特征为主要指标; 在鉴定酵母菌和放线菌时, 形态特征与生理特征两指标往往同时并用; 细菌因其形态特征简单, 在鉴定时, 则须同时应用较多的生理生化和遗传学指标。(五)微生物的分类鉴定方法和技术 现代的微生物分类鉴定法, 已从原有的按微生物表型进行分类鉴定的经典分类学, 发展到按它们的亲缘关系和进化规律进行分类鉴定的微生物系统学阶段。微生物的分类鉴定方法和技术可归纳为下列五种：1. 经典分类鉴定法根据微生物的形态结构、特征和生理生化特性等分类鉴定指标, 用经典和常规的研究方法, 观察和测定微生物的形态特征、运动性、酶反应、营养要求、生长条件、代谢特性、致病性、抗原性和生态学特性等一系列必要的鉴定指标, 然后对照查找权威性的菌种鉴定手册以确定其学名。2. 简便快速或自动化鉴定技术为解决常规鉴定方法工作量大、技术要求高和精确度低等难题，人们进行了种种改革传统鉴定技术的尝试, 现已有商品化的鉴定系统出售。如法国生产的“API”细菌数值鉴定系统、美国Roche公司生产的“Enterotube” 细菌鉴定系统 (又称肠管系统)、美国安普科技中心(ATC)生产的“Biolog” 手动和全自动细菌鉴定系统等。这些商品提供了系列化、标准化的鉴定技术, 具有小型、简便、快速或自动化的优点。3. 细胞化学成分分析鉴定法根据不同细菌和放线菌细胞壁的肽聚糖分子结构和成分的差异，采用细胞壁成分分析法,对菌种分类鉴定有一定的作用；放线菌全细胞水解液可分四类主要糖型, 故采用全细胞水解液糖型分析法可进行初步分类鉴定；位于细菌、放线菌细胞膜上的磷酸类脂成分, 在不同属中有所不同, 可用于分类鉴别；诺卡氏菌形放线菌所含枝菌酸的碳链长度有明显差别, 故对枝菌酸的分析可用于属的分类。此外，气相色谱技术可分析厌氧微生物细胞和代谢产物中的酸类和醇类等成分, 对菌种鉴定很有用。4. 数值分类鉴定法又称统计分类法或电子计算机分类法。通常以拟分类微生物的生理生化特征、对环境条件的反应和耐受性, 以及生态特性等大量表型性状的相似性程度为依据，按照数值分析的原理, 借助现代计算机技术进行统计, 计算出菌株间的总类似值，再进行比较和归类。5. 遗传分类鉴定法遗传分类鉴定是以GC含量和不同来源DNA之间的碱基顺序的类似程度及同源性为依据，从遗传学的角度在分子水平上估价微生物间的亲缘关系，从而进行分群归类。遗传分类鉴定的方法很多, 例如常用解链温度法测定DNA中的碱基比例 (GC比), 具有操作简便、重复性好等优点；常用固相杂交法 (直接法)进行DNA-DNA核酸分子杂交；采用16S或18S rRNA寡核苷酸编目分析法, 可定量地得知各被测菌株间的亲缘关系；应用全自动DNA序列仪测定微生物全基因组DNA序列, 对微生物的精确分类和鉴定工作非常有效。第二节 工业微生物学发展简史一利用微生物的自然发酵酿造传统食品在17世纪以前，虽然人们还无法直接看见微生物个体的存在，但是在生产实践中，逐步学会了利用自然界中的有益微生物，在自然接种和混菌发酵的条件下，借助微生物活动的产物来酿造各种传统食品和饮料，包括酒、酱、醋、泡菜、酸奶、干酪和面包等。例如, 在4000多年前, 我国酿酒业已十分普遍, 埃及人也已学会葡萄酒的酿造；2500年前, 我国人民已发明了酿制酱和醋。比果酒酿造需要更多工艺知识和较大生产规模的啤酒酿造，公元前3世纪在古代巴比伦的陶报上就已有记载。它记载了由谷类制造啤酒的某些品种，并且由有经验的酿造工匠组成了专业性酿造行业。他们已知道出芽的谷物（大麦芽）更容易酿造成啤酒。到了公元6世纪, 我国贾思勰所著的齐民要术中, 就详细地记载了制曲、酿酒、制酱、酿醋等工艺过程。显然，这一阶段是一个很漫长的时期，那时人们在对微生物本身还几乎是一无所知的情况下，凭生产实践经验。借助微生物的自然发酵来制造各种传统发酵食品，因而为工业微生物学的发展奠定了一定的基础。二微生物形态与发酵生理学的开创性研究17世纪中后期，荷兰人吕文虎克用自制的最大能放大近270倍的简单显微镜，观察了河水、雨水、牙垢等各种含菌样品，并将观察到的“微动体”(杆状、球状、螺旋状的细菌)图象描绘下来，寄给了英国皇家协会，首次揭示了自然界中确实存在着大量微小的生物 (图1 4)。这对后来微生物的形态与发酵生理的研究创造了极为有利的条件。图1 4 列文虎克用自制显微镜观察到的“微动体”A、B杆菌 C、D细菌运动轨迹 E球菌，F长杆菌，G螺旋菌，H一簇球菌18世纪中后期, 荷兰动物学家穆勒 (Mueller)对各种微生物进行观察描述和分类鉴定；19世纪前期Ehrenberg进一步将细菌与其它微生物分开，并新设了四个属；19世纪中后期，科恩(Cohn)等开始对微生物进行系统的分类，使越来越多的新种属被发现，分类系统不断更新。从19世纪60年代开始，法国人巴斯德 (Louis Pasteur) 在发酵生理学的研究方面作出了卓越的贡献(图1 5)，使当时的酒酿造业从困境中走了出来。巴斯德通过实验证实酒和醋的酿造过程实际上是微生物发酵的过程，而且认为不同发酵是由不同种类微生物所引起的，酒精发酵是由酵母菌引起的, 乳酸发酵、醋酸发酵和丁酸发酵都是由不同细菌所引起的；1864年，巴斯德又发明了著名的巴斯德消毒法。从此，人们不仅利用微生物发酵生产食品，也发酵生产菌体蛋白、各种溶剂和有机酸。图1 5 工业微生物学的奠基人巴斯德 图1 6 伟大的微生物学家柯赫19世纪7080年代，微生物纯种培养技术取得了很大的进步，1872年布雷费尔德(Brefeld)进行了霉菌的纯种分离与培养；1878年英国医生利斯特成功地纯化培养乳酸菌并测定了菌数；1881年德国细菌学家柯赫 (Robert Koch)，发明了用明胶固体培养基分离培养细菌的纯培养技术以及培养基配制技术（图1 6）； 1884年建立起了高压蒸汽灭菌法和细菌革兰氏染色法；1886年，丹麦的汉森 (Hansen)采用液滴培养法分离纯种啤酒酵母；1887佩特利 (Richard Petri)发明了双层培养皿, 取代试管进行稀释分离培养单菌落：柯赫的学生赫西的妻子用琼脂代替明胶。上述这些研究成果，使发酵技术的最基本手段微生物纯种培养方法基本建立起来，标志着传统发酵同近代发酵的一个重大转折。1897年法国的布赫纳 (Buchner)用石英砂和高岭土将啤酒酵母细胞磨碎，制成透明的富含蛋白质的酵母汁液（不含活细胞）并发现这种汁液（当时称为酿酶Zymase）与砂糖混合后可以发酵产生酒精。从而提出了发酵的酶作用过程的证据，也是进一步对发酵代谢机制开展研究的前奏。三. 微生物发酵工业的兴起与发展1928年夏天，英国细菌学家弗莱明 (Fleming) 在分离细菌时发现其中有一只培养皿内污染的霉菌很特别，菌落四周的细菌不能生长，在离菌落远处才有细菌生长。他做了很多实验，鉴定出该霉菌是点青霉，证实它能产生一种抗菌物质并取名为青霉素。限于当时的社会条件，这一重要发现未能得到人们的重视和支持。直到第二次世界大战爆发后，由于前线战伤感染致死的人很多，抗感染药物才受到人们的高度重视。40年代初，牛津大学病理学教授弗洛里 (Florey) 、钦恩（Chain）、亚伯拉罕(Abraham)等20多位学者组成攻关组，重新研究青霉素。经过了一年的努力，奠定了青霉素的治疗学基础。1941年第一次用青霉素进行治疗研究并小批量制备青霉素。1942年美国Merck公司开始工业化试产青霉素并用于临床治疗，使青霉素大显奇效，引起世界的震惊轰动，被誉为科学上的一项奇迹，是第二次大战中与原子弹和雷达并驾齐驱的三大发现之一。1943年，又发现了高产青霉素新菌种产黄青霉，钦恩确定了青霉素的分子结构, 并与弗洛里一起形成了青霉素工业化生产的工艺技术，使青霉素产量大大提高并在美国开始大量生产。1944年，瓦克斯曼 (Waksman) 在1941年发现的链霉素也投产了，此后，氯霉素在1947年、金霉素在1948年、土霉素在1949年、红霉素在1951年等也相继投产了。1957年卡那霉素问世；1959年Rolinson完成了6-氨基青霉素烷酸（6APA）的研究，使人工合成的高效广谱抗生素成为可能。因此，40、50年代成为抗生素工业发展的黄金时代, 抗生素的生产已逐步发展成为现代化的微生物发酵工业。四. 现代工业微生物学的新发展20世纪50、60年代, 受抗生素工业迅猛发展的影响, 工业微生物学史上开始出现寻找各种有益微生物代谢产物的热潮，而且工业微生物产品逐步向生产少量而贵重的生物药物新产品的方向发展。如利用微生物来生产维生素B2、B12、赤霉素、甾体激素，用两步法发酵生产维生素C、用发酵法或酶法生产各种氨基酸和核苷酸等。此外，微生物的其他产物, 如有机酸、酶制剂也已能用发酵法生产。上述各种微生物代谢产物越来越广泛地应用于工业、农业、医学等各方面。微生物的利用已组成一项新兴的发酵工业。在此期间，工业微生物学在应用研究方面，则向着更自觉更有效和可人为控制的方向发展。人们开始采用新的育种方法定向选育优良菌种，以达到提高产品产量的目的。由于人们对微生物代谢途径和代谢调控研究的不断深入，也由于对操纵子模型的阐明，使人们能通过人工方法突破微生物自我调控机制，使微生物能按照人们的要求大量积累某些代谢终产物或中间代谢产物, 从而达到生产各种各样有用的发酵产品或增加产品产量的目的。可见，代谢调节控制发酵技术的应用是微生物发酵工业的一次飞跃。该技术应用于氨基酸类、核苷酸类和新型抗生素类等发酵产品的生产已取得巨大成效。我国微生物学在应用研究方面也取得了重要的成果, 例如我国抗生素的总产量已跃居世界首位, 我国的两步法生产维生素C的技术居世界先进水平。从70年代初开始，固定化酶和固定化菌体技术已逐步发展起来并应用于工业化生产，它的优越性在于可连续、稳定、长时间地反复进行生物催化反应，生产效率高，易于控制、节省原料和能源，它使传统的微生物发酵工艺产生革命性的变化。固定化酶和固定化菌体新工艺已广泛应用于生产酒精、酒类、半合成抗生素、各种氨基酸、有机酸、核苷酸类的物质，也广泛应用于食品工业生产葡萄糖、高果糖浆等。从80年代初开始，各种微生物细胞的原生质体和原生质体之间的融合再生技术得到迅猛发展，并已成为微生物发酵工业中的另一种重要而有效的育种手段。微生物种内、异种间或异属间的细胞融合的结果形成了各种类型的重组融合体，赋予了微生物新的遗传性状，从而能产生新的组分，新的代谢产物或提高某种产物的产量等。随着分子生物学和分子遗传学的发展，一门新兴的综合性的应用学科生物工程学（又称生物技术）在世界范围内迅速地发展起来。生物工程技术体系主要包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程（微生物工程）和生化工程。在这五个技术体系中，基因工程起着主导的作用，因为只有通过基因工程技术改造过的微生物菌种和动植物细胞才能真正按人们的意愿，产生出特定的生物工程技术产品。才能给予这些技术以新的生命力。80年代初, 在基因工程的带动下, 传统的微生物发酵工业, 已从多方面发生了质的变化, 成为现代生物工程的重要组成部分。微生物不仅在整个生物工程中起着主角的作用，而且在基因工程中也占有十分重要的地位。因为在基因工程操作中，所采用的基因克隆载体（细菌质粒、噬菌体或病毒）几乎都是微生物或其组成部分，各种工具酶（限制酶、聚合酶、连接酶等）也几乎都来自各种不同的微生物。此外，作为重组DNA的受体系统很多也采用微生物的细胞（如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等）。现代工业微生物学已经与基因工程、细胞工程和酶工程等紧密结合起来，在生物工程这个高科技前沿带中充分发挥其主角的作用并得到新的发展。采用体外重组DNA技术改变细菌的代谢途径，以提高发酵产物的产量，已应用于抗生素、维生素、氨基酸、核苷酸和酶制剂的生产。将异体外源目的基因引入大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母菌，以改变宿主的遗传特性，从而使这些“工程菌”能够用于生产紧缺贵重的医药产品，如人胰岛素、干扰素、白介素、促红细胞生长素、肿瘤坏死因子等几十种产品，也能用于食品、化工、能源、环保等方面，从而建立了一批技术密集型的新兴生物技术产业。五.新世纪工业微生物学的发展趋势展望跨进新世纪的现代工业微生物学, 将呈现一幅比20世纪更加绚丽多彩的画卷。我们无法预知并勾划出这幅画卷上会出现的所有亮点, 只能粗略地预测其可能的几点发展趋势:新世纪微生物基因组学研究, 将进一步扩大到与工业、农业、环境、资源等密切相关的重要微生物，将为进一步利用和改造微生物菌种产生质的飞跃, 将为不断地提高目标产物的生产水平或生产新的产物提供了可能性。微生物将是新世纪进一步解决资源和能源等实际应用问题的最理想材料。例如，利用微生物将可再生的生物物质资源(各种植物的纤维素、半纤维素和木质素), 转化为能源(如酒精)和其它发酵产物。新世纪的工业微生物学将更广泛地与能源、信息、材料、计算机等多种学科交叉、渗透和结合。 因此加强学科间的交流和合作具有特别重要的意义, 它将开辟新的研究和应用领域, 并获得新的发展。微生物学的研究技术和方法, 将会在吸收其他学科的先进技术的基础上, 向自动化、定向化和定量化发展。21世纪, 微生物产业将呈现全新的局面, 除了更广泛地利用和挖掘不同生境 (包括极端环境)的自然资源微生物外, 基因工程菌将形成一批强大的工业生产菌, 生产外源基因表达的产物, 特别是药物的生产将出现前所未有的新局面。结合基因组学在药物设计上的新策略, 将出现以核酸为靶标的新药物的大量生产, 微生物制药工业的生产水平将进一步提高。在新世纪人类将完全征服癌症、艾滋病以及其他特殊的疾病。此外, 在21世纪, 随着工业生物技术高潮的到来，将出现一批崭新的微生物工业, 将生产出各种各样的新产品, 例如降解性塑料、DNA芯片、生物能源、精细化学品等, 为全世界的经济和社会发展作出更大贡献。本章小结1.人类第一次真正认识到微生物的存在, 还只是距今300多年前的事。1676年, 荷兰一位名叫安东列文虎克的业余博物学家, 用自制的简单显微镜，观察了各种含菌样品，首次向世人揭示了一个崭新的微生物世界。2.微生物是指所有形体微小，单细胞或结构简单的多细胞，或没有细胞结构的一群最低等的生物。整个微生物家族的成员包括三大类：非细胞类微生物 (真病毒、亚病毒), 原核细胞类微生物 (细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体、衣原体)、真核细胞类微生物 (酵母菌、霉菌、蕈菌、单细胞藻类、原生动物)。3.具有小体积大面积这一突出特点的微生物, 除了具有一般大型生物的共性外, 还带来了以下这些任何其它生物所不能比拟的五大特性：种类多, 分布广, 繁殖快, 代谢强, 易变异。4.微生物分类学是研究微生物分类理论和技术方法的一门科学, 对于我们认识、研究和利用各种微生物资源十分重要。微生物分类学的内容包括分类、鉴定和命名三个部分。5.微生物在所有界级分类系统中, 都占有最宽广的领域, 占据了绝大多数的“席位”, 若按六界系统，那么微生物在该分类系统中应分别属于病毒界、原核生物界、真核原生生物界和真菌界。微生物种以上的主要分类单位自上而下依次分为界、门、纲、目、科、属、种共七级。6.微生物分类鉴定的主要依据包括：经典的分类鉴定依据(形态特征、生理生化特性、生态特性、血清学反应), 现代的分类鉴定依据(细胞的化学成分、DNA碱基比例、DNA杂交率、rRNA寡核昔酸序列同源性、微生物全基因组序列)。7.微生物的分类鉴定方法和技术可归纳为下列三种：经典分类鉴定法, 简便快速或自动化鉴定技术, 细胞化学成分分析鉴定法, 数值分类鉴定法, 遗传分类鉴定法。8.工业微生物学发展简史可以概括为四个阶段：利用微生物的自然发酵酿造传统食品；微生物形态与发酵生理学的开创性研究；现代微生物发酵工业的兴起；现代工业微生物学的新发展。9.新世纪的工业微生物学将更广泛地与能源、信息、材料、计算机等多种学科交叉、渗透和结合。随着工业生物技术高潮的到来，将出现一批崭新的微生物工业, 将生产出各种各样的新产品, 为世界的经济和社会发展作出更大贡献。复习思考题1.什么是微生物？ 广义的微生物和工业微生物主要包括哪几大类？2.微生物具有哪些主要特性？ 试简要说明之。3.何谓微生物的分类、鉴定和命名？微生物的主要分类单位有哪些？其命名法则怎样？4.若按六界系统分类，生物可分为哪六界？工业微生物在该分类系统中的位置怎样？5.微生物分类鉴定的主要依据是什么？微生物的分类鉴定方法和技术可归纳为哪几种？6.现代工业微生物学的新发展主要表现在哪几方面？ 展望新世纪的工业微生物学, 有哪些发展趋势？