CTC的检测及其在乳腺癌方面的研究进展.doc

CTC的检测及其在乳腺癌方面的研究进展乳腺癌循环肿瘤细胞的检测方法 CTC检测的方法通常包括富集和检测两个步骤。由于外周血中CTC的数量非常少，一般在106107个单核细胞中仅含有1个，因此寻找富集CTC的方法显得非常重要，到目前为止绝大多数方法都是利用肿瘤细胞表面特异的标记物来将它们从白细胞中分离出来，其中最常用的上皮标记物是细胞角蛋白(cytokera-tins CKs)，细胞骨架蛋白(cytoskeletal proteins)以及上皮细胞黏附分子(epithelial cellular adhesion molecule，Ep-CAM)。CTC的鉴定必须具有足够的特异性及敏感性，以便将其从循环血液中分离出来。目前主要的方法有富集分离法、逆转录聚合酶链反应法、流式细胞法等。富集分离法1形态大小过滤法上皮肿瘤细胞大小分离法 (isolation by size of epithelial tumour cells，ISET)是一种根据上皮细胞的大小来分离的方法，ISET主要是利用一个8m的过滤孔，将较大的CTC与外周血白细胞分开，过滤之后那些假定的肿瘤细胞通过不同的标记物(比如CKs)被固定以及染色。其局限性在于一些较大的白细胞容易与肿瘤细胞混在一起，而一些较小的CTC也容易被滤过而丢失，因此这种方法缺乏较高的敏感性以及特异性。2密度梯度离心法使用淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque)的密度梯度离心法，其原理是：由于CTC和单核细胞(密度 1.077 g/ml)具有不同的密度，进而离心分离。但是由于CTC可能迁移到血浆层或者聚集成团，因此在这个过程中CTC很容易被丢失，而且同时要保证在离心过程中，各个层面不能混在一起。如果细胞长时间接触淋巴细胞分离液会对细胞产生毒性作用，因此限制了它的使用。密度梯度法由于不依赖特异的标记物，因此被认为是一种富集任何CTC的可行方法，但是也由于没有特异的标记物，所以该方法特异性较低。为了克服这些问题，出现了建立在密度梯度原理上的方法Oncoquick(Greiner Bio-One， Germany)，它能够通过一层特殊的膜来阻止全血各个层面的交叉污染。之后又出现了建立在阴性选择基础上的密度梯度法，主要是运用一种特殊的四聚体复合物(immunorosettes)与不想要的血液细胞结合，然后四聚体复合物在离心过程中被很容易的分离出去，CTC则可以从漂浮的层面中被提取出来，以增加CTC检测的准确性和特异性。3免疫磁珠富集法近年来随着纳米技术的不断发展， 纳米免疫磁珠的诞生为肿瘤细胞生物诊断提供了先进的分离手段。免疫磁性分离是基于细胞表面抗原以及某种蛋白(比如CKs、EpCAM等上皮标记物或CEA、HER2等)与连有免疫磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场的作用下， 通过抗体与免疫磁珠相连的细胞和某种蛋白被吸附而滞留在磁场中， 由于免疫磁珠表面的单抗只结合含有特异性抗原的细胞和蛋白， 从而达到与其他种类的细胞和蛋白相分离的目的。此种分离技术将抗原抗体反应的高度特异性和免疫磁珠的富集分离作用相结合，达到特异性的生物活性物质和细胞的富集和分离效果。但是这种方法由于一些非上皮细胞表达了上皮细胞的标记物而产生假阳性的结果，同样由于肿瘤细胞的异质性，有些肿瘤细胞没有表达特异的标记物而产生假阴性的结果。以核酸为基础的方法多项研究表明PCR的方法要比目前免疫细胞化学的方法敏感性强，其特异性方面可以通过设计针对感兴趣基因的寡核苷酸引物来提高。RT-PCR的方法是最常用来扩增目标基因的方法。多重RT-PCR通过选择多个标记物可以增加该方法的敏感性和特异性。但是以PCR为基础的方法仍有以下几方面的缺陷：需要将细胞裂解，因此不能进行细胞计数；由于在非肿瘤细胞内的不合理转录造成了一些假阳性的结果；血液中存在细胞自由核苷酸的扩增；由于一些非特异性标记物的使用可能造成假阳性结果；一些非恶性肿瘤的上皮细胞在某些侵袭性的过程中释放入血；由于肿瘤细胞标记物的低表达可能造成PCR的敏感性减低，以及存在一些PCR的抑制物都有可能形成假阳性结果。通过联合一种以上的标记物来进行检测，可以避免由于非肿瘤细胞的不合理转录所造成的假阳性结果，有报道：可以用实时定量PCR的方法将其尽量降低，通过对肿瘤标记物的定量分析，可以将真正的CTC和污染的细胞分离开来，同时还可以通过引物的合理设计来尽量避免假阳性结果的出现。流式细胞的方法流式细胞术(flow cytometry，FCM)是集计算机技术、激光技术、电子技术、流体动力学、细胞免疫学和单克隆抗体技术等多种高新技术与方法为一体的现代细胞分析方法。FCM检测CTC是将结合荧光物质的抗体与肿瘤细胞特异标志结合，使肿瘤细胞染色，之后用流式细胞仪进行分析。FCM检测CTC的优点为可定量计数CTC，可进行多参数测量；即可对细胞进行分析，又可进行分选。但是此种方法最常见的缺点为特异性较低。但应用光导纤维阵列扫描技术、加快细胞扫描速率或结合IMS富集分离肿瘤细胞，使得FCM检测CTC的敏感性显著提高。富集和检测相结合的方法CellSearch是目前美国食品和药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)唯一批准的检查CTC的方法。该系统主要有两部分组成，一部分用来结合抗EpCAM的磁珠对CTC富集，并用CK、CD45以及DAPI对富集细胞进行染色，另一部分可自动化对细胞进行拍照、分析和计数。CellSearch能快速分析样本并具有很好的重复性。对乳腺癌患者CTC检测具有极高可靠性。CTC在乳腺癌中的临床应用CTC在多种不同的肿瘤患者的外周血中都有不同程度的增高，但目前报道最多的是乳腺癌，下面就关于CTC在早期和转移性乳腺癌方面的一些文献作一综述1CTC与乳腺癌患者生存的关系近年来发表了大量的关于CTC与乳腺癌预后的关系，但是仍然难以得出一个比较可靠的结论，这是因为CTC检测方法、评判标准、研究对象以及临床分期等不同使这些报道无法比较。因此需要进行大规模的临床试验来验证CTC和乳腺癌患者的OS、PFS、DFS等之间的关系。2 CTC与转移性乳腺癌对转移性乳腺癌患者随访观察发现，辅助治疗前、治疗中和治疗后患者CTC 的水平均与其预后密切相关，CTC 可作为转移性乳腺癌患者的独立预后因子。Cristofanilli等在一个多中心、前瞻性、双盲临床试验中，用CellSearch系统检测177 例转移性乳腺癌患者7.5 mL 外周血中CTC 的数量，发现治疗前外周血中CTC 5 个的患者治疗后的中位无疾病进展期(progression 2 free survival ， PFS) 约2.7个月，OS约10.1个月;而CTC8个月，均明显长于CTC5个的患者。更有趣的是当CTC数量在治疗一个周期以后如果发生了增高，那么可能提示治疗的失败，治疗一个周期以后CTC增高的患者中位OS和PFS分别为2.1个月和8.2个月；而相应的CTC没有增高的患者OS 和PFS分别为7.0个月和22个月，两者之间具有统计学差异。之后的另一项研究也证明了这一点，在一项共入组80名转移性乳腺癌的患者当中，约61%的患者外周血中的CTC5个/7.5 mL，而且在治疗期间监测患者CTC 水平也可准确反应疾病进展情况以及对治疗的反应性如何。结语CTC是远处转移病灶形成的重要前提和基础，及早检测CTC对指导临床医师准确判断患者预后和病情具有重要意义;动态监测CTC变化，有利于及时了解患者病情，为制定个体化综合治疗方案提供依据。未来的研究应通过随访观察，进一步阐述CTC与乳腺癌患者预后的关系，并对CTC在乳腺癌综合治疗中的应用价值进行深入探讨。