医学免疫学实验指导.doc

医学免疫学实验指导（供医学、药学各专业使用）主编：刘彦平编委：邵嘉会 陆东明 李 萍 高 翔青海大学医学院病原生物学与免疫学教研室2008年10月前 言医学免疫学是医学院校必设的基础课程之一，按教学大纲要求医学免疫学的实验课时占总学时的1/3左右，说明该学科具有理论与实践紧密结合的特点及实验教学在学科中的重要性。本课程设置要求学生不仅要掌握基础理论、基本知识，而且要学习和掌握各项基本技能。据此，我们编写出医学免疫学实验指导一书，力求规范实验教学，从整体提高教学水平和教学质量。本书结合教学工作实际，共编写14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，并附有一定量的思考题。本书依教学进程安排实验次序，可帮助学生巩固基础理论知识，培养学生基本技能，提高教学效果。免疫学和免疫学技术的发展日新月异，医学教育的改革不断向纵深发展，限于编者的学术及认识水平，本书难免存在缺点和不足。为此，希望广大师生对本书提出宝贵意见，以便及时加以改进。 编 者 2008年10月目 录实验室规则4实验一 显微镜的结构与使用4实验二 白细胞的吞噬及溶菌酶试验7一、小吞噬试验(中性粒细胞吞噬功能试验)8二、大吞噬试验8三、溶菌酶测定9实验三 巨噬细胞（白细胞）移动抑制试验9实验四 硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验11实验五 凝集反应12一、玻片凝集试验12二、人类ABO 血型鉴定试验（玻片法）13三、试管凝集反应14四、间接凝集试验15五、间接乳胶凝集抑制试验16实验六 沉淀反应17一、琼脂扩散试验18二、免疫电泳20三、火箭免疫电泳20四、对流免疫电泳22实验七 补体的溶细胞作用23实验八 补体结合试验24一、溶血素单位滴定24二、补体单位滴定 24实验九 血清补体活性测定27实验十 淋巴细胞转换试验29实验十一 玫瑰花环形成试验31实验十二 变态反应试验32一、豚鼠过敏试验33二、皮肤超敏反应33实验十三 免疫浊度试验34实验十四 循环免疫复合物的检测35实验十五 免疫标记技术37一、酶联免疫吸附试验37二、酶免疫组化技术38三、酶标免疫定量测定40四、免疫荧光技术41五、斑点金免疫渗滤试验43六、斑点免疫层析试验44实验室规则实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段，为保证实验效果，同时避免病原微生物的实验室内传染，保障实验操作者的安全，特制定如下规则：一、学生在实验课前，应认真预习所要进行实验的内容，明确实验目的，了解实验原理，熟悉所要使用的仪器、药品的性质及操作程序，如有疑问，应事先请教指导教师。二、尽量不带个人生活、学习用品入实验室，必须要带的物品如书本、文具应放在远离实验操作的指定位置。三、进入实验室应穿白大衣，离开时将白大衣脱下并反折叠带走，在实验室内应保持安静，遵守秩序，不得大声喧哗，随便走动或拆卸仪器、搬弄标本。四、实验室内禁止吸烟、进食及饮水，严禁用嘴吸移液及湿润标签，尽量不要用手触摸头面部及身体其他暴露部位。五、如遇不慎而打破菌种管或使有菌材料污染皮肤、衣物、桌面等情况，应及时报告指导教师，切勿隐瞒或自行处理。六、实验中所被污染过的器材、物品及其他盛过有菌物的容器、应用完后立即投入已准备的消毒剂（如来苏尔、氯胺液）中，不可随意仍放。七、注意观察分析实验结果，独立思考解决实验中所遇到的问题，要严格按操作程序进行实验。八、要爱护公共财物，节约水电及试剂材料，不得将实验物品私自带出实验室。如遇仪器、用品损坏，应报告指导教师并按规定予以赔偿。九、实验结束后，应清理实验用品，实验废弃物（包括实验动物尸体）应收入或倒入指定的地方和容器内。每一同学均应服从卫生值日安排，认真负责地做好清洁卫生。十、离开实验室前，应用84消毒液将双手浸泡510分钟，然后用清水洗净。最后离开的同学应注意关水、关电、关窗、关门。如有借用的物品和仪器要及时归还。实验一 显微镜的结构与使用【实验目的】1.熟悉光学显微镜的结构和成像原理。2.掌握普通光镜的使用方法，尤其是油镜的正确使用。3.了解暗视野、相差显微镜的原理和使用方法。【实验用品】1.器材：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸。2.标本：细菌革兰染色玻片标本、普通变形杆菌24h内培养液、啤酒酵母新鲜培养的活标本。【内容和方法】一、普通光学显微镜的结构和使用方法微生物是肉眼看不见而必须借助于光学或电子显微镜将其放大数百乃至数万倍才能观察到的微小生物，因此显微镜是认识和研究微生物最重要和最基本的工具之一。因此，掌握其使用方法是进行微生物研究的基本技能。1.普通光镜的基本结构普通光镜无论其外观形状如何，它都由两大部分组成，即机械装置部分和光学系统部分。机械部分包括镜座、镜臂、载物台及台上的标本推进器、镜筒、物镜转换盘以及升降调节器等，其主要作用是支撑、固定镜头、调节物象焦距、搁置和移动标本。光学系统包括反光镜、聚光器、物镜和目镜。它的作用是收集光源并聚集于标本上，然后通过透镜放大成像映与眼帘，是肉眼本不能分辨的物体得以清楚观察（图1-1）。图1-1 光学显微镜的结构光学系统是光学显微镜的核心部分，而物镜又是其中最重要的部件。一般的光镜配有3-4个物镜，有10倍的低倍镜、40倍的高倍镜和100倍的油浸镜（有的配有一个4倍的物镜头）。标本的放大主要靠物镜。为了使用方便，常用红、黄、蓝、白的色圈分别标记物镜倍数。另外，在镜头上还刻有一些符号和数值，低倍镜上刻有10/0.25、160，10指放大倍数，0.25指镜口率（N.A），160表示镜筒长度（mm）。高倍镜刻有40/0.65和160/0.17，40为放大倍数，0.65指镜口率，160表示镜筒长度，0.17则表示使用时所要求盖玻片的厚度。油镜上刻有100/1.25和160/0.17，该数值也表示放大倍数、镜口率、镜筒长度、盖玻片厚度，除此之外，油镜头上还常刻有一个“油”或“oil”字。2.普通光镜的使用方法（1）对光和调焦：首先将显微镜平置于实验台上，转动物镜转换器使低倍镜与镜筒垂直到位（听到“咔”声即可），然后将反光镜凹面对着光源翻动，侧面观察聚光器明亮或从目镜观察视野明亮即说明对光完成。如果此时虽对光较好却是也不够明亮时，应检查聚光器的光圈是否打开，聚光器是否升至最高。对好光后即将标本置于载物台上的标本夹中（注意标本面向上），先用低倍镜观察。用粗调节器调出物像后，再用细调节器调出清晰物像。在换高倍镜观察时，由于高倍镜视野范围比低倍镜小，故须先将观察内容移至视野中央后再换之。有时显微镜存在偏心现象，此时要记住其偏心的方向和距离。（2）油镜的原理、使用、保护在免疫学中主要使用的是油镜。油镜是因为在使用时需用香柏油等作介质而得名。光学显微镜的放大倍数与玻璃透镜的大小有关。油镜的透镜小，镜孔也小，观察时由于聚光器聚集的光源要通过载玻片、空气，才能进入物镜中。玻璃与空气的折光率不同，会产生折射，使一部分光线失掉，进入物镜的光线减少，致使观察视野暗淡，物像不清。如果使用折射率与玻璃相近的油介质，即可减少折射，增加视野亮度，提高分辨率。如图1-2所示。图1-2油镜头使用原理 最常用的油介质为香柏油和石蜡油，其折光率分别为1.515和1.46，与玻璃的折光率1.52相近似（空气为1）。故可达到上述减少折射，增加光亮度的效果。使用油镜时应先将集光器升至最高，光栅增至最大。转开物镜镜头，在玻片上加一滴镜油，再转换油镜头。眼从侧方看，调节粗调节器，使镜头浸入镜油中，以轻轻接触玻片为止(注意勿压碎玻片)。眼看目镜，调节粗调节器缓慢下降载物台，看到物像，立即停止，改用细调节器调出清晰物像。观察结束后，应用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭油镜头，再用于擦镜纸擦去残存二甲苯。下降集光器，竖起反光镜，将物镜镜头摆成“八”字型，对号送入镜盒内。二、暗视野显微镜和相差显微镜简介观察暗视野显微镜和相差显微镜实物或图片。暗视野显微镜是将普通光学显微镜换装上特制的暗视野聚光器或者在普通光镜聚光器上加一个中央遮光板改装而成。使用暗视野聚光器或光板，光线不能通过聚光器的中心部位透入物镜；而只能从周边斜射经标本反射进入物镜，因此视野背景是暗的，标本成为亮点。使用暗视野显微镜可检查不经染色，在普通显微镜下不易看清的活体微生物，如活的细菌、螺旋体等，它的缺点是不能观察生物体的内部结结构。相差显微镜也称相衬显微镜。相差显微镜具一个特殊的由环状光圈和聚光镜组合的转盘聚光镜和一组特别的相差物镜（内装相位板），能使直射光和绕射光产生干涉，改变其光相与振幅，形成明暗差，增强观察物体的立体感，并使细胞的内部构造清晰，因而可观察活体微生物的形态及某些内部细微结构。【注意事项】1.取送显微镜时动作要轻，一只手托镜座，一只手持镜臂，防止反光镜、目镜、物镜等脱落损坏。2.油镜用后一定要擦洗，以防止油干影响其使用寿命。注意擦镜时一定要用专用擦镜纸。3.使用油镜时，一定要等标本干后才能加香柏油。滴油时应避免气泡形成。【实验报告与思考题】1.为什么用油镜要等标本片干后才能滴加香柏油？2.油镜有哪些标志？如何使用油镜？3.如果视野中光线太强或太弱，应该怎么做？4.用油镜观察革兰染色细菌标本并绘图。实验二 白细胞的吞噬及溶菌酶试验【实验目的】1.熟悉白细胞的吞噬及溶菌酶试验的原理和方法。2.通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。【实验原理】机体内具有吞噬功能的细胞大致分为两大类，即小吞噬细胞和大吞噬细胞。小吞噬细胞一般指血液中的中性粒细胞，大吞噬细胞则是存在于组织中的巨噬细胞和血液中的大单核细胞。它们构成机体天然防御机能。本实验通过体外或动物体内的细胞吞噬及溶菌酶试验，以证实机体的非特异性免疫机制。【实验用品】1.器材：显微镜、载玻片、厚凹玻片、接种环、采血针、滴管、湿盒、恒温培养箱、注射器、针头、打孔器、平皿、酒精灯、火柴。2.材料、试剂：3.8枸橼酸钠、2碘酒、75酒精、瑞氏染液、蒸馏水、6可溶性淀粉、1鸡红细胞悬液、溶壁微球菌(100mgm1)、l15molL磷酸盐缓冲液(pH6.4)、琼脂、标准溶菌酶(100ugm1)、新鲜鸡蛋清(1:10)、生理盐水、香柏油。3.菌种：白色葡萄球菌24小时斜面培养物。4.动物：小白鼠 【内容和方法】 一、小吞噬试验(中性粒细胞吞噬功能试验) 1.方法 (1)取厚凹玻片一片，在凹孔中用滴管加入一滴3.8枸橼酸钠溶液。 (2)依次用碘酒、酒精消毒手指或耳垂及采血针后，从消毒部位采取三大滴血加入凹孔中混匀。 (3)将接种环烧灼灭菌后，刮取少许白色葡萄球菌置于凹孔血液中搅匀。 (4)将上述凹玻片放人湿盒，于37温箱中作用45分钟，注意每15分钟混匀一次。 (5)取出凹玻片，用烧灼灭菌的接种环将凹孔中血液搅匀后取血34环于载玻片上，用另一载玻片推成薄血片。接种环烧灼灭菌后放回原处。 (6)待血片自干后，用瑞氏染液染色。用吸管取瑞氏染液数滴滴于上述血片上先染1分钟。然后加等量缓冲液，轻轻晃动混匀，继续染5分钟后水洗，用吸水纸吸干后镜检。 2.结果分析 油镜检查，先寻找白血球，观察胞浆中有无吞噬的细菌。如结果正确可见染成紫色的细胞核及被吞噬的细菌，细胞桨则为淡红色。 随机计数100个中性白细胞，记录发生吞噬和未发生吞噬的白细胞数，计数吞噬细胞百分率。 二、大吞噬试验 1.试剂配制 (1)6可溶性淀粉肉汤：取肉汤培养基100ml，加入可溶性淀粉6g，混匀后煮沸灭菌，冷却后置4冰箱保存(只能保存一周)。使用时37水浴溶解。 (2)1鸡红细胞悬液：取肝素抗凝鸡血1m1，加生理盐水99ml混合。 2.方法 (1)试验前3天，于小白鼠腹腔内注射6可溶性淀粉肉汤lml(注射时切勿刺伤内脏)。 (2)试验当天，于每只小白鼠腹腔内注射1鸡红细胞悬液lml并轻揉腹部。 (3)注射后30分钟，用注射器吸取腹腔液少许，置于洁净载玻片上，推成涂片、晾干。用瑞氏染液染色。 (4)油镜观察小白鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞现象(鸡红细胞为有核红细胞)，并计算吞噬细胞的百分率。 瑞(Wright)氏染液：瑞氏染粉0.1g，甲醇60ml，先将染粉置研钵内加少量甲醇研磨，然后加入全部甲醇。配好的染液要装瓶塞紧，置二周后使用。 三、溶菌酶测定 1.试剂配制 (1)溶壁微球菌菌液的制备：菌种于使用前先在琼脂斜面上传代一次，然后接种于琼脂斜面培养基中，37培养24小时后收集菌苔，称重、用pH6.4磷酸盐缓冲液配成100mgml菌液。经70水浴l小时杀菌，放置4冰箱备用。(2)pH6.4 115mol/L磷酸盐缓冲液(沙伦生PBS)：甲液：无水Na2HPO4946g溶于1000ml蒸馏水。乙液：无水KH2PO4 9078g溶于1000ml蒸馏水。然后取甲液27ml，乙液73ml，加NaCl 0.5g即成。2.方法及结果 (1)将1磷酸盐缓冲液琼脂100rnl加热溶化，待冷至5060时加入微球菌菌液1m1(每m1琼脂内含标准溶壁微球菌1mg)混和均匀，注入无菌平皿，每个平皿15ml。 (2)琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打4个孔，孔径5mm，孔距相等。 (3)用1 m1注射器吸取唾液(由实验者收集自己的唾液于洁净平皿中取下层清液使用)，加入琼脂孔内，以注满为度。同时以标准溶菌酶、鸡蛋清作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照，分别作好标记。(4)将平皿置于实验台上于室温中过夜，第二天观察琼脂孔周围的溶菌环。根据溶菌环直径的大小比较唾液及二个阳性对照的实验结果，分析试剂中溶菌酶的含量。【注意事项】1.小吞噬实验中要掌握好抗凝剂与血液的比例，否则会使红细胞及白细胞破坏，影响结果的观察。 2.大吞噬实验时使用小白鼠处于直立姿势有利于腹腔渗出液的抽取。3.溶菌酶实验中应注意无菌操作，否则杂菌生长会影响溶菌环的观察。【实验报告与思考题】 1.在吞噬细胞中发现细菌时，如何区别吞噬的细菌和粘附在吞噬细胞表面的细菌? 2.简述机体非特异性免疫的概念及特点?实验三 巨噬细胞（白细胞）移动抑制试验【实验目的】1.熟悉巨噬细胞或白细胞的移动抑制试验的原理方法及意义。2.通过本实验了解细胞免疫的特异性。【实验原理】根据白细胞可以游走的特点，将事先用布氏杆菌致敏的小鼠腹腔渗出细胞置毛细玻璃管中37培养，24小时候白细胞可从管口向外移动扩散成扇状。若再次遇到相应的抗原时，由于致敏淋巴细胞能释放出巨噬细胞移动抑制因子（MIF）或中性粒细胞移动抑制因子（NIF），抑制巨噬细胞、中性粒细胞的移动，故白细胞游出毛细管口面积减少。根据此情况计算的移动指数（MI），可反映机体的细胞免疫水平。因此本实验是检测细胞免疫功能的方法。【实验用品】1.材料药品：布氏杆菌致敏的小鼠、布氏杆菌抗原、Hanks液、RPMI1640培养液、凡士林、8%淀粉肉汤。2.器具：水平离心机、解剖显微镜（或低倍显微透射仪）、恒温箱、毛细玻璃管（内径1mm，两端粗细一致，长78cm）、平底凹孔玻璃板（凹孔直径2cm）、盖玻片、注射器、砂轮、带盖瓷盘。 【内容和方法】 一、动物细胞制备 布氏杆菌致敏的小鼠腹腔注射8%淀粉肉汤0.5ml，34天后将动物处死，向腹腔内注射2ml Hanks液，无菌取出腹腔渗出细胞。配成10%的细胞悬液（或用Hanks液洗涤2次后，配成8107个/ml的白细胞悬液）。 二、操作方法 1.用长针头注射器吸取10%的细胞悬液，装入预先封好一端的毛细玻璃管内（约3/4体积），每份标本实验组和对照组各装4支，装入各管的细胞悬液应相等。 2.将毛细管置于离心管中，于水平离心机内，2000r/min离心5分钟后，用小砂轮沿毛细管的细胞-液面之间划痕，小心折断。 3.将含有细胞的毛细管端沾少量凡士林，置平底凹玻片中固定，加入RPMI1640细胞培养液，实验组培养液中加入相应的抗原，即2106/ml布氏杆菌，对照组使含细胞培养液，加盖玻片，将凹玻片水平置于带湿纱布的瓷盘中，37孵育24小时后观察结果。 三、结果分析取出凹玻片，用解剖显微镜或低倍显微透射仪测出各毛细管的巨噬细胞或白细胞移动的扇面长短直径，按以下公式计算出移动指数（MI）。 实验组（加抗原）移动直径平均值 MI= 对照组（不加抗原）移动直径平均值MI0.8为阳性，0.8MI1.2为正常值【注意事项】1.在实验中，一批试验用的毛细管口径要相同。 2.试验中需严格按无菌操作方法进行，不能接触洗涤剂、消毒剂等，以免影响结果。【实验报告与思考题】 1.记录结果，计算出MI，并作解释。 2.白细胞移动抑制试验有何实际意义?实验四 硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验细胞生化功能的改变也可以间接地反映有关细胞的非特异免疫功能，本次实验进行中性粒细胞的硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验。【实验原理】细菌感染时给你正常的中性粒细胞能量消耗剧增，耗氧量增加，糖代谢活跃。有氧化还原反应，糖氧化过程中所脱的氢可被吞噬的或渗透到中性粒细胞胞质内的NBT染料接受，使淡黄色的NBT还原成蓝黑色的甲臢，以折光性强的点状或斑块状颗粒沉积于细胞内。镜下检查NBT阳性细胞数量，便可推知中性粒细胞的杀菌功能。【实验用品】1.NBT染液：取0.28gNBT加入100ml生理盐水，用超细玻璃滤器过滤，分装，4保存。2.0.77%沙黄O染液。3.肝素：用无菌生理盐水配制25U/ml肝素溶液。4.培养液：取0.5ml正常人血清加入0.3ml无菌生理盐水和0.6mlNBT染液。5.甲醇、无菌生理盐水等。6.碘酒与酒精棉球、温箱、凹玻片、湿盒、注射器、吸管等。 【操作方法】 1.取肝素抗凝外周静脉血0.1ml和培养液0.1ml加于凹玻片孔中混匀，置湿盒3720min，中间摇动一次，再置室温15min。 2.取一滴混悬液于载玻片一端推成薄片，空气中快速干燥。3.甲醇固定1-2分钟。4.用0.77%沙黄O染液5min，水洗，干后油镜下检查。 【结果判断】凡中性粒细胞胞质内含有斑点状或块状的甲臢颗粒沉积者为NBT阳性细胞，计数100200个中性粒细胞，计数NBT阳性百分率。【实验讨论】1.注意事项 NBT染液应过滤，不要残留颗粒。所用器皿应洁净，避免玻璃表面因素参加NBT的还原作用。单核细胞还原NBT的能力很强，在计算NBT阳性细胞时应除外。2.方法评价 该实验简便、快速、便于重复，但特异性差，易出现假阳性和假阴性结果。3.临床意义 正常人参考值应在10% 以下；全身细菌感染病人NBT阳性细胞在10% 以上；病毒感染、无菌血症的局部感染或循环中无细菌产物（如内毒素）时，NBT值正常。慢性肉芽肿等吞噬细胞功能缺陷病无NBT阳性细胞，故可作为诊断该病的指标。实验五 凝集反应【实验目的】1.了解凝集反应的原理、基本类型及其用途。2.熟悉玻片凝集试验、试管凝集试验、间接凝集试验的实验方法和结果分析。【实验用品】1. 材料试剂：伤寒杆菌、大肠杆菌1824小时琼脂斜面培养物、伤寒杆菌H血清、伤寒杆菌H菌液、待测孕妇尿液、HCG阳性孕妇尿液、1:10稀释伤寒杆菌诊断血清、ABO血型标准血清、类风湿免疫诊断试验（用变性IgG致敏的乳胶颗粒）、HCG致敏乳胶试剂、兔抗HCG诊断血清、待测血清、生理盐水。2.器材：洁净载玻片、巴氏吸管、乳胶皮头、接种环、酒精灯、特种铅笔（或记号笔）、小试管、牙签、采血针、75%酒精棉球、无菌干棉球、试管架；1ml、5ml刻度吸管、37恒温箱（或37/56水浴箱）、显微镜。【内容和方法】一、玻片凝集试验(slide agglutination)1.原理玻片凝集试验(slide agglutination)是将已知的抗体直接与未知的颗粒性抗原物质(如细菌、立克次体、钩端螺旋体等)混合，在有适当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。此法属定性试验，主要用于检测抗原，如ABO血型鉴定、细菌鉴定和分型等。2.方法（1）取载玻片一张（平置实验台上），用特种铅笔或记号笔划分为3格，并标明1、2、3。 （2）取巴氏吸管一支，套上乳胶皮头后，吸取1:10 稀释的伤寒杆菌诊断血清12 滴于第1、2 格内，另取巴氏吸管一支，吸取生理盐水12 滴于第3格内。（3）将接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌，冷却后取少许伤寒杆菌菌培养物与第1、3格内的诊断血清、生理盐水混合并涂抹成均匀悬液。然后用同样方法取少许大肠杆菌培养物与第2格内的的诊断血清混合并涂抹成均匀悬液。静置数分钟后观察结果。 3.结果观察与判定 如上述混合悬液由均匀混浊状变为澄清透明，并出现大小不等的乳白色凝集块者即为阳性（）；如混合物仍呈均匀混浊状则为阴性（）。如肉眼观察不够清楚，可将玻片置于显微镜下用低倍镜观察。本次实验结果第1 格内应出现大小不等的乳白色凝集物（阳性），第2、3格内无凝集物，混合液仍呈均匀混浊状（阴性）。【注意事项】（1）伤寒杆菌为肠道致病菌，在实验中务必严格无菌操作，遵守实验规则，用后的载玻片应立即投入指定的容器中，接种环必须做灭菌处理。（2）取细菌培养物时，不宜过多，与抗血清混合涂抹时，必须将细菌涂散，涂均匀，但不宜涂得太宽，以免很快干涸而影响结果观察。二、人类ABO 血型鉴定试验（玻片法）1.原理人类ABO血型抗原有A和B两种。A型红细胞膜上有A抗原，B型红细胞上有B抗原，AB型有A和B两种抗原，而O型则不含有A和B抗原。据此，如分别将抗A和抗B血清与待测红细胞混合，抗A和或抗B血清与红细胞表面上的相应抗原结合而引起红细胞凝集，根据其凝集状况便可判定受试者的血型（见表5-1）。表5-1 血型鉴定试验结果与判定凝集反应 诊断血清血型抗A 抗BA+ -B- +AB+ +O- -“+”表示凝集，“-”表示无凝集。2.方法（1）用酒精棉球消毒无名指指端皮肤或耳垂，待酒精干后用无菌采血针刺破表皮，用毛细吸管取血12滴，放入含1m1 生理盐水的小试管中，混匀，即成待检红细胞悬液(约2)。取血后，应立即用无菌干棉球压迫针眼止血。（2）取凹玻片或载玻片一张，用记号笔分为两格，并注明A、B字样。（3）用巴氏吸管吸取抗A血清、抗B血清各一滴分别滴于A、B格内（也可用2ml的一次性注射器代替巴氏吸管）。（4）另用巴氏吸管取待测5%红细胞悬液，于A格和B格内各加一滴。然后分别用牙签将抗血清与红细胞搅拌均匀(也可轻轻晃动载玻片以促其充分混匀)，以加速其反应。将玻片放置于实验台上静置数分钟后，在白色背景下观察凝集情况。3.结果观察与判定如混合液由均匀红色混浊状逐渐变为澄清，并出现大小不等的红色凝集块者即为红细胞凝集；若混合液仍呈均匀混浊状，则表明红细胞未发生凝集。如肉眼观察不够清楚，可将玻片置于显微镜下用低倍镜观察。不凝集（-） 凝集（+）4.注意事项（1）试验用凹玻片或载玻片要清洁，注明A 和B 字佯。（2）所用抗A、抗B血清必须在有效期内(注意试剂包装说明的有效期限)使用。（3）待检红细胞悬液不宜过稀或过浓。（4）要及时观察结果，以防时间过长使标本干涸而影响结果观察和判定。三、试管凝集反应1.原理试管凝集反应是一种定量试验，常用已知颗粒性抗原来检测未知抗体及其含量。方法是用生理盐水将待测血清在试管中进行连续倍比稀释，然后于各管中加入等量已知抗原悬液，37过夜或56水浴2小时后，观察有无凝集并根据凝集程度，判定待检血清抗体的效价。本法主要用于某些传染病的辅助诊断及流行病学调查，如伤寒、副伤寒及布氏杆菌病的诊断等。2.方法（1）取洁净小试管8只并依次排列于试管架上，用特种铅笔或记号笔按顺序注明号码。（2）将1ml刻度吸管套上乳胶皮头，吸取生理盐水0.9ml 加至1号试管，余下每管中分别加入0.5ml 生理盐水。（3）用1ml刻度吸管取0.1ml抗伤寒杆菌“”血清于第1管中。（4）用1ml吸管在1号管内连续吸吹三次，使血清与生理盐水充分混匀，然后吸取0.5ml加至2号试管，随后按上法进行倍比稀释直至7号试管，最后从7号管中吸出0.5ml混合液弃去。至此，17号试管的血清稀释度依次为1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，而8号管中只有0.5ml生理盐水，此管系阴性对照管（见图5-1）。（5）取5ml吸管吸取伤寒杆菌H菌液，加于18号试管中，各加0.5ml。此时，每支试管中的液体量均为1ml，17号试管的血清最终稀释度分别为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280。（6）持试管架轻轻振荡摇匀，以使血清与菌液混合均匀。然后置37恒温箱过夜或56水浴箱2h，再观察结果。血清0.1ml血清稀释度 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640图51 血清等倍稀释法图示3.结果与判定（1）对照管（第8管）：上清液混浊，管底有沉淀的物，如斜置试管可见其流动，若轻轻振荡便分散呈混浊状。（2）试验管：按 1-7号管依次观察。如有凝集（此为阳性），可见管底有凝集块，平铺于试管底部，边缘向上卷曲或出现凝结颗粒，轻摇即升起，“H”菌液的凝集块呈絮状，液体上部澄清。阴性者则与对照管（第8管）相同。（3）凝集强弱的判定与记录。+：表示细菌全部凝集。试管底部有大量凝集块，上清液澄清透明。+： 表示绝大部分细菌凝集，凝集物较多或与+相当，上清液澄清。+：表示部分(约50)细菌发生凝集，凝集物较少，呈颗粒状，上清液基本澄清。+：凝集物很少，需仔细观察才能发现，上清液基本浑浊。-：表示不凝集。与阴性对照管相同。（4）判定凝集效价(滴度)：以凝集物明显可见，且血清稀释度又最高的那一号试管的血清最终稀释度为血清效价。4.注意事项（1）实验操作应认真仔细，如向试管内插放吸管宜轻，以免戳穿试管底；取货加样应准确；稀释血清时应仔细地逐管进行，以防跳管。（2）观察结果时，最好不要振摇试管，以免凝集物摇散振碎而影响他人观察。四、间接凝集试验1.原理本实验是将已知的可溶性抗原吸附或偶联在与免疫无关，有一定大小的颗粒性物质（载体颗粒）表面上，然后再与相应抗体混合，并在有适当电解质存在的条件下，由抗原抗体的特异性结合而发生肉眼可见的载体颗粒凝集。该实验可用于细菌、病毒、钩体、梅毒螺旋体抗体，以及某些自身抗体（如抗核抗体、抗肾抗体、抗甲状腺抗体等0的检测。可用作载体的物质有红细胞（如Rh-O型血红细胞、绵羊红细胞、兔红细胞等）、聚苯乙烯乳胶颗粒，活性炭以及硅酸铝颗粒等。若所用载体为红细胞，即称间接血凝实验，如载体为乳胶颗粒，则叫间接乳胶凝集试验（见后述）。2.方法（类风湿因子测定）（1）用生理盐水将待测血清稀释1:20。（2）用巴氏吸管吸取1:20待测病人血清一滴于载玻片上，然后加一滴类风湿免疫诊断试剂。（3）持玻片轻轻晃动使之充分混匀。5分钟内出现均匀的乳白色凝集颗粒者为阳性，无凝集者为阴性。3.注意事项应在5分钟内观察结果。因放置过久可出现假阳性。五、间接乳胶凝集抑制试验1.原理将待测样品与已知抗体混合作用一定时间后，再将其与相应抗原致敏的乳胶颗粒混合。如待测样品中含有相应抗原，便可与加入的抗体结合，当再加入致敏乳胶颗粒后，就没有相应的抗体与乳胶颗粒表面的抗原结合而发生凝集，这就是乳胶凝集抑制试验（如图5-2）。所以，不发生凝集者为阳性，表明待测样品中含有相应抗原；发生凝集者为阴性，提示待测样品中无相应抗原。图5-2 间接凝集抑制试验本法主要用于检测抗原。如乳胶妊娠试验，就是先将待测孕妇尿液（含有人绒毛膜促性腺激素，HCG)与已知抗HCG抗体作用，从而抑制了抗HCG与致敏乳胶颗粒表面上的HCG结合，于是乳胶凝集被抑制。2.方法（见表5-2）（1）取凹玻片一张置实验台上，用标记笔划线分为三格，并注明甲、乙、丙。（2）用巴氏吸管取生理盐水一滴加入乙格中，然后取待测孕妇尿一滴加在甲格中，另用巴氏吸管取HCG阳性孕妇尿一滴加在丙格中。（3）于甲、乙、丙格中各加入一滴兔抗HCG血清。分别用牙签将反应液充分搅拌均匀，静置30秒至1分钟。（4）于甲、乙、丙格中各加入一滴HCG致敏乳胶试剂，分别搅拌均匀。静置10分钟左右后观察结果。表5-2 乳胶妊娠试验程序甲乙丙待测尿生理盐水HCG阳性尿抗HCG抗HCG抗HCG致敏乳胶致敏乳胶致敏乳胶结果+或-+-3.注意事项（1）所用诊断试剂必须是有效期内。用前应充分摇匀。（2）拌搅用的牙签不能共用。（3）加样不宜过多，玻片应平置，以防两格之间反应液溢流相混。（4）如肉眼观察不够清楚，可借助放大镜观察。【实验报告与思考】1.记录玻片凝集实验的材料、方法、结果（最好用文字加图示），并讨论。2.记录血型鉴定试验的材料、方法与结果。3.记录试管凝集试验的材料、方法、结果及测定效价（可用表格方式表示）。4. 记录类风湿因子乳胶凝集试验的材料、方法与结果。试对结果作讨论分析。5.记录乳胶妊娠试验的材料、方法、结果及判定。试验结果予以分析讨论。6.玻片凝集试验与试管凝集试验有何区别？直接凝集试验与间接凝集试验有何不同？实验六 沉淀反应【实验目的】1.掌握琼脂单向扩散、双向扩散的基本原理、方法、结果分析及临床用途。2.熟悉免疫电泳的基本原理、方法。3.了解火箭免疫电泳的基本原理和方法。【实验用品】1. 材料试剂：1.5%盐水琼脂、人IgG、IgA、IgM抗血清、标准参考血清；待测血清或唾液、AFP免疫血清、脐带血清、兔抗人血清、1%琼脂糖、0.5mol/LpH8.6巴比妥缓冲液。2.器材：恒温水浴锅、温箱、三角烧杯、吸管、琼脂板（塑料）、微量加样器、打孔器（直径3mm）、坐标纸、标尺、铅笔、电泳仪、聚苯乙烯塑料条、注射器及针头等。【内容和方法】一、琼脂扩散试验1.单向扩散（1）原理单向扩散系定量试验，通常以已知抗体测定未知抗原。试验中首先将一定的抗血清（抗体）混合于琼脂内，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，将一定量的抗原加入孔中，抗原向孔四周扩散，与相应抗体结合，在抗原抗体比例合适处形成白色沉淀环，沉淀环的直径大小与抗原的浓度呈正比。以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应测得沉淀环的直径作为纵坐标，以抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线，量取待检抗原的沉淀环直径，即可从标准曲线中求得其含量。该实验主要用于检测标本中的各种Ig含量和血清中补体成分的含量。（2）方法参考血清的稀释：取冻干Ig参考血清一支，加入0.5ml蒸馏水溶解，用0.01 mol/L pH 7.27.4PBS倍比稀释成1:101:160 五种浓度。免疫琼脂板制备：将适宜浓度的人Ig抗血清与预先融化好的1.5%琼脂在56水浴中混匀，每板内灌注3.3ml，制成琼脂板（IgG、IgA、IgM），并做好标记。然后用3mm的打孔器在琼脂板上打孔，孔距11.5cm。孔内琼脂用注射器针头挑出。加样：用微量移液器取10l各种不同浓度的参考血清准确加入免疫板的孔内，每一浓度均加两个孔，然后用上述加样方法，取10l适宜稀释度的待测血清，加入免疫反应板的孔内。反应：将加样的琼脂板置水平湿盘内，于37温箱反应2448小时后，取出反应板，用标尺测其沉淀环直径并记录。标准曲线的绘制：以各浓度标准抗原的沉淀环直径为纵坐标，相应孔中抗原Ig浓度含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线（见图6-1）。待测标本Ig（IgG、IgA、IgM）含量的计算：以待测标本的沉淀环直径查标准曲线，将查得的Ig含量乘其稀释倍数，即得该标本的Ig含量。几种试剂的配制：A.1.5%琼脂的配制：秤取1.5g琼脂，用含0.01%柳硫汞的生理盐水100ml溶解，加热使之呈液体状。B. 0.01 mol/L pH 7.2PBS的配制：先配制0.2 mol/L Na2HPO4及NaH2PO4溶液，取72ml 0.2 mol/L Na2HPO4与28ml0.2 mol/L NaH2PO4混合，然后用0.85%NaCl溶液稀释20倍即成。图6-1 琼脂单向扩散试验的标准曲线图（3）注意事项制备琼脂板时温度不宜过高使抗体变性失活，亦不宜太低，以免使琼脂凝固不匀。沉淀环的直径均已mm为测量单位。2.双向扩散（1）原理双向扩散为定性试验。将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上相对应的孔内，两者相互扩散，在比例适宜处形成沉淀线。如抗原与抗体无关则不形成沉淀线。此实验用来检测抗原或抗体的纯度，亦可用已知的抗原（抗体）来测未知的抗体（抗原）。临床上常用于检测甲胎蛋白（AFP），作为原发性肝癌等的辅助诊断。（2）方法琼脂反应板的制备：取融化好的1%盐水琼脂3.3ml,置琼脂板内，待冷即制成琼脂反应板。打孔：用打孔器在琼脂板上打孔，孔距6mm,呈梅花形排列，即中间一孔，周围六孔，将孔内琼脂用注射器针头挑出。加样：用微量移液器取10lAFP免疫血清准确加入中央孔内，上下孔各加10l脐带血清作为阳性对照。其余孔加等量的待测血清。反应：将加好样的琼脂板置水平湿盘内，于37温箱反应24小时。结果分析：待测标本如出现沉淀线，且与阳性对照的沉淀线吻合，则为阳性反应。如无沉淀线出现或是与阳性对照沉淀线交叉的沉淀线则为阴性（见图6-2）。图6-2 双向扩散结果示意图（梅花孔法）（3）注意事项加样时，注意不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形状。反应时间要适宜。时间过长，沉淀线可解离至假阴性；时间过短，则沉淀线不出现。就爱样时抗体、阳性血清及待测标本应各用一支加样器，以免混淆，影响实验结果。二、免疫电泳1.原理免疫电泳是免疫扩散与电泳相结合的免疫学分析技术，具有极高的分辨力。主要用于抗原组成的定性分析。免疫电泳实际上分为两个步骤：电泳，待测抗原在琼脂中进行区带电泳。由于不同蛋白质组份的大小、质量及所带的电荷不同，在电场的作用下，可将不同组份区分开。琼脂扩散，电泳后，在琼脂槽内加入相应的抗血清，进行免疫扩散，根据出现沉淀线的数量及位置即可分析抗原的组份机器性质。2.方法（1）琼脂反应板的制备：将载玻片置水平台面，并将塑料条置于玻片上面，然后取4ml融化好的1%琼脂糖与玻片上，待自然冷凝后取出塑料条，即成琼脂槽。最后根据需要在琼脂板上打孔，挑去孔内琼脂。（2）加样：用微量移液器取10l待测血清准确加入孔内。（3）电泳：用电泳仪（一般生化检验分析蛋白的电泳仪即可）电泳，选择电压一般为34V/cm，电泳时间为1.5小时。（4）扩散：取兔抗人血清加入琼脂槽。置湿盒内，3724小时后观察结果。（5）结果观察：在琼脂槽的两边出现相对应的沉淀线。3.注意事项（1）有时抗原抗体形成的沉淀线很弱，肉眼不易观察，可以染色。（2）染色标本应在白色背景下观察，不染色标本需在斜射光的暗色背景下观察。（3）琼脂板两端需用滤纸等物作桥，与桥内缓冲液接通。搭桥要完全紧密接触。以防电流不均发生沉淀线偏斜。三、火箭免疫电泳1.原理火箭免疫电泳是将电泳与单向扩散结合的一种免疫技术。将抗体溶入琼脂后制板，在琼脂板的一侧打孔，加入待检样品及不同浓度的标准抗原。电泳时抗原在含定量抗体的琼脂中向正极移动，并形成浓度梯度，在适宜的部位形成火箭状的沉淀峰。沉淀峰的高度与抗原的含量成正比，故可定量测定抗原。2.方法（1）制板：将抗体血清按一定比例与溶化好的1.5 %琼脂在56 水浴中混匀，迅速浇注成2 mm厚的琼脂板。（2）打孔：待琼脂凝固后，于距玻板一长边10mm处，以3mm孔径打孔器打孔一排，孔距5mm。（3）加样：取不同浓度的标准抗原及待测抗原各10l加入孔中。（4）电泳：将抗原孔置于负极端，进行电泳（3V/cm），时间6-8小时。3.结果（1）标准曲线的绘制：以沉淀峰高为纵坐标，抗原浓度为横坐标，在半对数纸上绘图。（2）待测抗原含量的测定：量出待测孔沉淀峰高，查标准曲线可查得抗原的相应浓度，乘其稀释倍数即得抗原的含量（图6-3）。图6-3 火箭免疫电泳图(为标准抗原；为标本抗原)-+ 4.注意事项（1）如采用高压电泳时（8-10 V/cm），需配冷却装置。（2）正式实验前应做预试，调整好抗原、抗体的比例。（3）待测样本多时为避免先加样孔抗原自由扩散造成电泳后出现孔周扩大的沉淀峰，可先将琼脂放入电泳槽，在10V/cm电泳状态下加样。（4）搭桥为火箭电泳的关键环节之一，桥宽应与琼脂膜一致。【实验报告与思考题】1.测定未知抗体及测其纯度时应选何种打孔模式？三孔模式与梅花样模式适合于何种性质的双扩？2.免疫电泳与双向扩散比较其优点何在？3.试分析下述火箭电泳中可能出现的现象：（1）无沉淀峰（2）出现几个峰（3）峰扭曲4.在火箭电泳中，火箭峰逐渐变高且浓度变淡是何原因？应如何调整至正常？四、对流免疫电泳对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis, CIEP) 是建立在免疫沉淀反应的基础上，通以电流，使蛋白质抗原、抗体在电场中作定向加速度免疫双扩散，从而加速沉淀的形成。1.原理一般抗体（IgG）的等电点为pH59，血清蛋白抗原的等电点为pH45，在pH8.28.6的缓冲溶液中，抗体所带负电荷较少，正电荷较多，而且分子在直流电场中它易受溶液中负电离子的吸引作用及溶液的电渗作用而向负极迁移；在同样条件下，抗原所带正电荷少负电荷多，分子也较少，电泳迁移快，虽也受电渗影响，但仍向正极泳动，若抗原抗体相对应，则在两者相遇于最适比例形成白色沉淀线，此即为对流免疫电泳的阳性结果（见图6-4）。图6-4 对流免疫电泳2.试剂与器材（1）抗原：人血清。（2）抗体：抗人血清。（3）0.05mol/L pH 8.6巴比妥缓冲液。（4）1.5%离子琼脂：取备用的3%琼脂块（蒸馏水配置），加热融化后加入等体积的巴比妥缓冲液，加热混匀备用。（5）0.05%氨基黑10B。（6）电泳槽、电泳仪。（7）其他物品：玻片、吸管、打孔器、毛细滴管等。3.操作方法（1）制备琼脂板：以吸管取琼脂4ml趁热倒在载玻片上，琼脂凝固后即成离子琼脂板，然后按图6-4打孔，用注射器针头挑出孔内凝胶，再用热融琼脂封闭孔底，然后将琼脂板置于电泳槽中，槽两侧搭用纱布或滤纸作盐桥。（2）加样：将待测抗原样品10l加在阴极侧孔内，加样量与琼脂面平。（3）电泳：电势梯度4 V/cm长（恒压）或者电流3-4mA/cm宽（恒流），电泳0.5-1小时。4.结果判断电泳毕，关闭电源，取出琼脂板。在黑色背景上方，透过散射光线，首先观察阳性对照组、阴性对照组的白色沉淀线是否出现；再看试验孔，如孔间未出现这样的沉淀线，则该待检血清为阴性血清（沉淀线如不清晰，可将琼脂板放入湿盒37或室温数小时。必要时可按常规洗涤、染色）。【实验讨论】1.本方法宜采用带有适当电渗的琼脂为介质，应注意电渗的方向和强度，电渗作用过强会使多数蛋白质向阴极移动。2.如果抗原也是免疫球蛋白，或抗原抗体的扩散率比较接近，这种情况一般不宜做对流免疫电泳。3.试分析还有哪些因素会影响电泳结果？ 实验七 补体的溶细胞作用【实验目的】掌握补体溶细胞作用的原理。【实验原理】补体与颗粒型抗原抗体复合物结合时，产生溶解反应。如果颗粒型抗原为绵羊红细胞，可发生溶血反应。【实验用品】1.材料药品：抗原：0.5%绵羊红细胞；抗体：溶血素；补体；生理盐水。2.器具：小试管、吸管、37水浴箱。 【操作方法】 1.取小试管三支，按下表加入各物（容量单位为毫升）。 2.将上述3管放入37水浴箱内15-30分钟，观察有无溶血现象。 管号0.5%绵羊红细胞溶血素（2u）补体（2/u）生理盐水结果10.50.50.50.520.50.51.030.50.51.0实验八 补体结合试验【实验目的】1.熟悉补体结合试验的原理和方法及其应用。2.了解溶血素单位、补体单位、抗原单位的测定方法。【实验原理】补体结合试验（complement fixation text ,CFT）是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统，来检测未知的抗原或抗体的血清学试验。有五种成分参与，分为指示系统和待检系统(已知抗原和未知抗体或已知抗体和未知抗原)。补体用新鲜豚鼠血清。方法是将已知的抗原或抗体与未知标本(可能含相应抗体或抗原)充分混合，再加入补体作用一段时间，最后加入指示系统。若待检系统有相应抗体或抗原，则能形成抗原抗体复合物，从而消耗了补体不出现溶血现象，此为阳性；相反，出现溶血则为阴性。补体结合试验的影响因素较多，正式试验前需对已知成分作一系列滴定，尤其是补体，应选择适宜的量参与反应，避免假性结果。每次试验尚需同时设立多种对照，以作为判断结果可靠性的依据。该法对颗粒性或可溶性抗原均适用，临床上常用于检测某些病毒、立克次氏体和螺旋体感染者血清内的中的抗体，亦可用于某些病毒的分型。一、溶血素单位滴定【材料】1.抗体：溶血素血清。2.抗原：2绵羊红细胞悬液。3.补体：（1:30）取自豚鼠新鲜血清4.其它：生理盐水、小试管、试管架、吸管、37水浴锅。 【方法与结果】1.按下表8-1于各试管分别加入不同稀释的溶血素0.2ml及其成分。2.充分混合后置于37水浴锅中30分钟，然后观察结果。3.凡最高稀释度的溶血素可呈现完全溶血者为一个单位。举例：上表结果表明，第11管（即1：9600倍稀释）0.2毫升溶血素为一个单位，在溶血反应中常用0.2毫升中含有2个溶血素单位的稀释液。配置时可取1：100倍稀释的溶血素1ml加生理盐水47ml。二、补体单位滴定【材料】1.抗体：2单位溶血素。2.抗原：2绵羊红细胞悬液。3.补体：（1:30）取自豚鼠新鲜血清4.其它：生理盐水、小试管、试管架、吸管、37水浴锅。 【方法与结果】1.按下表8-2于各试管分别加入1:30稀释液的补体。2.依次加入其他各成分至每管中，37水浴一定时间后观察结果，判定补体单位。3.补体单位：凡能使一定量红细胞发生完全溶解的最小补体量，称为1个确定单位。如上表中第3管开始出现溶血现象，因此第3管（0.1ml）所含补体量为1个确定单位。 由于在实际应用时补体有一部分损失，故须酌量增加一些，通常取其次高一管补体量称为1个实用单位。在下例中： 1个确定单位=0.1ml 1:30稀释的补体。1个实用单位=0.12ml 1:30稀释的补体。4.补体的稀释：若使每0.2ml补体含2个实用单位，可照下法计算。30:20.12=X:0.2X=（0.230）0.24=25即将补体稀释25倍，用0.2ml即可。（三）正交试验正交试验可以做定性的，液可以做定量的。本实验用伤寒杆菌的提取液为抗原与其免疫血清做定性实验。【材料】1.抗体：1:5稀释的伤寒血清。2.抗原：1:50稀释的伤寒抗原，1:80稀释的痢疾抗原。3.补体：（1:25）取自豚鼠新鲜血清。4.指示系统：2单位溶血素，2%绵羊红细胞。5.其它：同预备试验。 【方法】按表8-3顺序操作。【结果】观察各管溶血情况，记录并分析其意义。【注意事项】1.以细菌作抗原时，应使用细菌的提取液而不用悬液，通常滴定找出最适稀释度。2.血清需5630分钟灭活。3.补体性质不稳定，以实验的当天采取效果最好，操作时尽量减少在室温停留的时间。表8-1 溶血素滴定 (单位：ml)试管号溶血素0.2稀释度补体（1:30）生理盐水2%绵羊红细胞摇匀后置于37水浴锅中30分钟。结果11:10000.20.40.2完全溶血21:12000.20.40.2完全溶血31:16000.20.40.2完全溶血41:20000.20.40.2完全溶血51:24000.20.40.2完全溶血61:32000.20.40.2完全溶血71:40000.20.40.2完全溶血81:48000.20.40.2完全溶血91:64000.20.4