研究生基因工程实验指导.doc

广东省高教厅重点实验室现代生物技术实验室实验教材基因工程技术实验指导(研究生教材)华南农业大学现代生物技术实验室基因工程实验分室二零零五年二月编 者 的 话 本实验指导是为广东省高教厅重点实验室之一的“现代生物技术实验室”开设的“基因工程原理和方法”而编写的。本课程主要面向广州石牌地区六所高校的研究生，也包括部分高年级本科生。该课程以实验为主，为保证学生在修读本课程时有较好的理论基础，要求所有修课学生预修“分子生物学”或“分子遗传学”。 本课程实验采用了一个内容连贯的实验系统(用质粒载体克隆植物DNA片段)，作为同学们掌握DNA体外重组基本技术的训练(实验一至实验七)。另外，根据本研究室多年教学、研究工作的经验，我们还把反映近年基因工程技术发展的PCR、Southern杂交技术等纳入实验内容，以保证学生修完本课程后能较快地开展相应研究工作，更好地适应未来研究工作的需要。 本实验指导由庄楚雄、穆虹、易继财、姚涓、吴豪、张群宇、刘耀光、梅曼彤等老师参加编写，易继财老师负责指导书的编辑等工作。 本实验指导为试用第三版，试用后我们将根据各校修课的情况和要求作进一步修改，敬请兄弟院校的同行多提宝贵意见。 编 者 2005年2月目 录基因工程实验室学生守则 3实验一 碱裂解法抽提质粒DNA 4实验二 琼脂糖凝胶电泳 7实验三 DNA的酶切 9实验四 目的片段的回收 11实验五 DNA的体外连接 12实验六 重组DNA的转化 15实验七 重组转化子的快速鉴定 18实验八 多聚酶链式反应( PCR ) 19实验九 植物DNA的抽提 21实验十 基因组DNA的Southern杂交分析 24附录I. 各种试剂的母液配方 28附录II. 常用实验器具的清洗方法 31主要参考书 32基因工程实验室学生守则 1. 实验课前必须预习实验指导，了解实验原理和基本操作过程。 2. 实验课不得无故缺席、迟到或早退。非课表规定的实验时间，应按任课老师的安排，准时来进行操作。 3. 实验课时，应自觉遵守课堂纪律，保持实验室的安静与清洁卫生，不得大声谈笑，不得抽烟、随地乱丢纸屑、吐痰等。 4. 实验前清点好仪器、用具与试剂，实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台面和地面上。 5. 实验中应严格遵守操作规程进行实验，细心观察实验现象，并如实记录实验结果。每个实验完成后，要写实验报告。 6. 实验完毕，应清洗好当天所用的器皿和用具，整理好仪器与实验台面，经任课教师同意方可离开。 7. 使用仪器、药品、试剂和各种其它物品需注意节约。洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。 8. 废液可倒入水槽内，同时放水冲走，强酸、强碱等腐蚀性液体，应先用水稀释后，方可倒入水槽内，并放水冲走。废纸等其它固体废物，不得倒入水槽，应倒入废物桶内。 9. 严禁随意动用非当天实验所需使用的仪器和物品，使用仪器应严格按仪器使用的程序进行，贵重仪器需在任课老师的指导下进行操作。实验过程中如仪器出现故障，应及时向任课老师汇报情况，如违反使用规定造成的损坏，使用者将负责修理与赔偿。 10. 每次实验课由任课教师安排学生轮流值日，值日生负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性的工作，最后关好水电、门窗，经任课教师检查同意后方可离开。实验一 碱裂解法抽提质粒DNA一、目的 学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。二、原理 质粒DNA的提取常用碱裂解法、煮沸法、SDS法、Triton-溶菌酶法等，其中以碱裂解法最为常用。本方法有质粒DNA产量高、快速等优点。其原理为: 在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNA酶(RNaseA)消除。再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质。三、实验材料 含质粒pBluescript II的大肠杆菌DH10B。四、仪器设备 高压灭菌锅 超净工作台 恒温摇床 台式离心机（冷冻式或非冷冻式） 旋涡振荡器五、实验用具 培养用试管 量筒 冰盒 微量离心管 微量取液器 吸管头若干六、试剂(配制方法见附录) LB培养基 氨苄青霉素(Amp, 100 mg/ml) 20% SDS 溶液I； 溶液II(最好现配现用)； 溶液III(-20预冷) 4 N NaOH 3 M NaAc(pH5.2) 无水乙醇 TE缓冲液(pH 8.0) RNase A(10 mg/ml) 70%乙醇 饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，注：在本实验指导的其它章节省略为“酚/氯仿”，而“氯仿”均指已加入了1/24体积的异戊醇)七、实验步骤1. 细菌的培养(1) 配制LB液体和琼脂培养基，并高压灭菌。(2) 在含Amp 100 mg/ml的琼脂培养基平板上(划线或涂抹)培养出单菌落(37，1820小时)。(3) 在培养管中加入含Amp 100 mg/ml的LB液体培养基(45 ml/管)，挑取单菌落至培养基中。将培养管倾斜插在摇床中，37摇过夜(约200 rpm，1416小时，一般不超过18小时)。如需大量提取，挑取单菌落至接入含50 ml LB培养基的三角瓶中，37摇18小时。2. 质粒DNA的抽提（如使用冷冻离心机，设为4预冷）吸取1.5 ml菌液至1.5 ml离心管中。 离心(5000 rpm, 2分钟)，弃上清液。如想提取多一点DNA，再吸取1.5 ml菌液至同一离心管中，离心，弃上清液。用移液器尽可能除去上清液。加入150 ml溶液I ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。加入250 ml溶液II ，缓慢地上下翻转离心管10多下，温和混匀。室温下放置5分钟。加入180 ml预冷的溶液III ，上下翻转离心管10多下，温和混匀，冰浴10分钟，或放入20冰箱5分钟（避免过长时间产生冻结）。离心 (12000 rpm，5分钟，4)。（离心完后把离心机温度设为20）。移取上清液。加2/3倍体积的酚/氯仿抽提，离心 (12000 rpm，5分钟)。 移取上清液（约500550ml），加2倍体积无水乙醇（大量提取时上清液的容量大，可用0.6倍体积异丙醇代替乙醇），混匀。离心（12000 rpm，5分钟，室温)，倒掉酒精。离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精。用0.5 ml 70酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉酒精。离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精，风干10分钟。加50100 ml TE(含20 mg/ml RNaseA)溶解DNA沉淀。37放置数小时，-20保存备用。高拷贝质粒DNA的产量一般为35 mg/ml菌液。此DNA可直接用于限制性内切酶切割等反应。如需要更高纯度的DNA，可进一步纯化。3. 质粒DNA的进一步纯化加入TE使DNA溶液为100 ml，加入100 ml酚/氯仿，充分振荡。离心(12000 rpm, 5分钟)，吸取上清液。加入1/10体积的3 M NaAc，加2倍体积的预冷无水乙醇，混匀。置于-70oC冰箱约10分钟以上或-20oC冰箱30分钟至数小时。离心（12000 rpm，15分钟，4oC)，倒掉酒精，离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精。用0.5 ml 70酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉酒精。离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精，风干。加50100 ml TE溶解DNA沉淀。(如大量提取质粒DNA，溶液I，II，III的用量可相应增加，如培养液为50 ml时，溶液I，II，III的用量可分别为2 ml，4.0 ml，3 ml）。 本实验方法提取及纯化的质粒DNA的纯度只能满足一般目的的要求。对于纯度要求很高的情况，如作为克隆载体和测序的模板，最好使用厂商提供的质粒纯化试剂盒提取。八、实验注意事项1. 高压消毒需专人看管，压力至0.5磅时拔下电源插头放气，继续加热至1.0磅保持20分钟(通、断开关控制)。2. 无菌操作台使用前，开紫外灯灭菌，开紫外灯时勿开鼓风装置。3. 对抗菌素不能用高温灭菌，需待培养基灭菌后冷却到不烫手的时候再加入。4. 为避免细菌污染环境，多余的菌液经煮沸杀灭后方可倒入洗涤槽。5. 加入溶液II、溶液III摇匀时一定要温和，不能剧烈摇动。6. 在酚/氯仿萃取后，吸取上清液时，应注意勿将下层酚/氯仿吸入以免带入杂质；但也不要留下太多上清液，使DNA损失较多。九、实验时间安排1. 第一天下午配制液体和琼脂培养基。（5:30）左右在琼脂培养基平板上划线接菌，培养过夜长出单菌落。2. 第二天下午（5:30）挑取单菌落植菌培养过夜。3. 上午9:00左右停止培养，于室温或4存放。下午抽提质粒（纯化在实验二电泳期间进行）。实验二 琼脂糖凝胶电泳一、目的 学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的纯度、浓度与分子量。二、原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭(EB)为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。 质粒DNA有环状超螺旋、开环、和线性三种构型，电泳时其迁移率各不同(超螺旋 线性 开环)。三、实验材料 上次实验提取的质粒DNA。四、实验设备 微波炉 电泳仪 微型电泳槽 紫外透射检测仪 五、实验用具 微量取液器 吸管头若干 加样板 量筒100 ml1 三角瓶500 ml1 透明胶带六、试剂(配制方法见附录) 琼脂糖 10TBE电泳缓冲液 10载样缓冲液 EB母液（0.5 mg/ml）DNA(Hind)七、实验步骤 1. 制胶 (1) 称取0.8 g琼脂糖加入盛有100 ml 1TBE电泳缓冲液的500 ml三角瓶中，摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。在微波炉或电炉上加热至琼脂糖完全熔解，放在天平上加蒸馏水至原重量。冷却到约60后，加入100 ml的0.5 mg/ml溴化乙锭（EB，终浓度为0.5 mg/ml）或者5 ml的Gold View溶液，并摇匀。 (2) 用胶带将制胶板两端封好，将溶解的琼脂糖(约50)倒入其中，直至厚度为46 mm。 (3) 插入适当的梳子，在室温下冷却凝固。 (4) 充分凝固后撕掉两端的胶布，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。 (5) 将凝胶置入电泳槽中，加电泳缓冲液至液面覆盖凝胶12 mm。 2. 点样 用微量取液器(P20) 吸取实验一的DNA样品2 ml于点样板小孔中，再加入8 ml TE或电泳缓冲液及1 ml的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点10mlDNA(Hind酶切,30 ng/ml)作为分子量标准。 4. 电泳 打开电源开关，调节电压至35 V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约一小时后即可观察。 5. 观察 将电泳好的凝胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细和荧光强度，可粗略估计该样品DNA的浓度。同时根据已知分子量的标准DNA，通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。八、注意事项 1. 用微波炉煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。 2. 煮好的胶应冷却至50左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。 3. 倒胶注意厚度(46 mm)，充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4冰箱10多分钟，以加速胶的凝固。 4. 加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。 5. 一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。 6. 凝胶中含有EB，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。九、时间安排一个下午完成。在电泳进行期间，按实验一进行质粒DNA的纯化。实验三 DNA的浓度测定及酶切一、目的 学习利用紫外分光光度法测定DNA溶液浓度及利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果，为以后的连接作准备。二、原理 DNA的吸收光谱峰在260 nm处，据计算，测定此波长下DNA溶液的OD值， 当OD260= 1时，双链DNA含量约为50 mg/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质的吸收峰在280 nm处，在测定DNA含量时，还常计算OD260/OD280之值，如该值为1.82.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。 目前已发现三类不同的限制性内切酶即I型、II型和III型。其中II型能专一识别碱基顺序，并在该处切断双链DNA，因而在基因工程中得到广泛应用。DNA经限制性内切酶作用产生两种断裂状态：粘性末端或平末端。限制性内切酶HindIII识别的碱基序列为：酶切作用后产生5突出的粘性末端 5-AAGCTT-3 A 5-AGCTT 3-TTCGAA-5 TTCGA-5 A 酶切反应需Mg2+及其它一些辅助离子和一定的盐离子浓度，不同内切酶对盐离子有不同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量过高(5%)，会使酶的识别位点发生改变，产生星活性(star activity)。绝大多数酶的反应温度37，也有个别要求在50 65。三、实验材料 提纯的质粒DNA和水稻基因组DNA。四、仪器设备 分光光度检测仪 电泳仪 微型电泳槽 紫外透射检测仪 恒温培养箱 五、实验用具 微量取液器 微量离心管(0.5 ml1) 吸管头若干 点样板六、试剂 限制性内切酶HindIII及对应的缓冲液(试剂商提供) 无菌双蒸水 10TBE电泳缓冲液 0.8%琼脂糖 载样缓冲液七、实验步骤 1. DNA浓度纯度的测定 取实验一的DNA 2 ml (约100 200 ng)至一干净的离心管，加入198 ml蒸馏水稀释。先加200 ml 蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定，然后倒掉蒸馏水，加入200 ml已稀释的DNA溶液，测定260 nm及280 nm的光吸收值(OD260及OD280)，计算DNA浓度及OD260/OD280比值。 2. 酶切：按下表配制酶解混合液DNA缓冲液(1/10 V) 10 mlDNA45 mg加双蒸水至总体积(V)100 ml酶(HindIII)40 U 混匀，37保温1.5 3小时，电泳前在4保存。 3. 电泳检测：取酶解液310 ml电泳 (具体步骤见实验二)。 4. 观察结果。八、注意事项 1. 用紫外分光光度法测DNA含量时，对纯度不高的DNA测定结果往往不准确(偏高)，且测定所用DNA量较多。用琼脂糖凝胶法电泳(与已知浓度的DNA标准系列对照)定量更为可靠。 2. 酶切的DNA应具备一定的纯度，其中不能含迹量的酚、氯仿、SDS等。 3. 反应总体积中甘油的浓度要小于5，即内切酶的体积应小于10%反应总体积(购来的酶含50甘油)。 4. 内切酶从-20冰箱取出后，应放入冰浴中，在其它试剂加完后最后加。 5. 每次取酶必须使用新的灭菌吸管头，1个吸管头不能反复使用，更不能交叉使用。 6. 注意混匀，可用用手指轻弹管壁，使酶切体系所有成分混匀，然后短暂离心，使管壁液滴沉入管底。九、时间安排DNA浓度纯度测定、酶切，一个下午；电泳检测一个下午。实验四 目的片段的回收一、目的 DNA分子经限制性内切酶消化以后，产生较小的片段，我们须从中选出我们需要的片段（目的片段），进一步作亚克隆，或用作探针。通过本实验，我们将学习掌握从琼脂糖凝胶电泳中回收DNA片段的一种方法。二、原理 回收目的片段的方法有多种，常用的有冻融法、低熔点琼脂糖法、透析袋法、电泳回收法、玻璃孔回收法等。本实验采用电泳回收法。通过特别的V形电泳槽，将挖出的含有目的片段的凝胶置于V形槽前，接通电泳电源，DNA即进入V形管中，回收V形管中溶液即可，V形管较小，回收的DNA片段能保持较高的浓度。三、实验材料 实验三酶切的水稻基因组DNA。四、仪器设备 电泳仪 电泳槽 V形管回收电泳槽 紫外透射检测仪 五、实验用具 微量取液器 吸管头若干 刀片 微量离心管 扁头镊子六、试剂 0.8%琼脂糖 10TBE电泳缓冲液 7 M醋酸铵 载样缓冲液七、实验步骤 1. 大量酶切产物的电泳分离。 琼脂糖为0.8，选用大型电泳槽及厚梳子，并在低电压下电泳以提高分辨率。 2. 紫外灯下用刀片小心切出含1000bpDNA片段的凝胶。 3. 把凝胶片置于特制的“V”型槽平台上，在“V”型槽中加入0.5TBE电泳缓冲液(使其刚好淹过胶面)，再在“V”型孔中加入7 M NH4Ac，接通电源进行电泳。 4. 紫外灯下检测凝胶块是否含有DNA，判断DNA是否全部进入V形管溶液中。 5. 当DNA进入V形管中，放掉电泳槽中的缓冲液，吸出V形管中的溶液。 6. 溶液加两倍体积的无水酒精，混匀，置-70oC两小时或-20oC过夜。 7. 12000 rpm离心10分钟，沉淀用70酒精洗一次，风干，加入10 ml TE。取1 ml与8 ml TE及1ml载样缓冲液混合，电泳检查并根据带的亮度估算其浓度。八、注意事项 挖含目的DNA的凝胶时，尽量减少周围凝胶的带入。九、时间安排 一个下午。实验五 DNA的体外连接一、目的 学习DNA重组技术中的核心步骤，DNA片段之间的体外连接方法，将实验四回收的目的片段与载体质粒片段进行定向连接。二、原理 DNA连接酶催化两个双链DNA片段5端磷酸和3端羟基之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶主要有：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌连接酶两种。T4 DNA连接酶的底物可为：(1) 一条链带有缺口的双链DNA分子；(2) 两个存在互补粘性末端的双链DNA片段；(3) 两个存在平末端的DNA片段；(4) RNADNA杂合体中，具缺口的RNA和DNA分子。大肠杆菌DNA连接酶适当的底物只是带缺口的双链DNA分子和具有同源互补粘性末端的不同DNA片段，它不能催化平末端DNA分子之间的连接。 T4 DNA连接酶催化DNA连接的反应分三步进行：(1) 辅助因子ATP中磷酸基团与T4 DNA连接酶上的Leu残基的NH2结合，形成酶-AMP复合物；(2) 酶-AMP复合物活化DNA链5端的磷酸基团，形成磷酸磷酸酯键；(3) DNA链3端的羟基活化与5端磷酸根形成磷酸二酯键，释放AMP，完成DNA链间的连接。大肠杆菌DNA连接酶催化DNA分子连接的机制及反应过程大致与T4 DNA连接酶相同，只是辅助因子为NAD+。用于克隆的质粒载体在酶切成线状后，一般需用碱性磷酸酯酶(CIP或BAP)进行去磷酸化处理，以防止载体自身环化，减少不含重组子的菌落产生。三、实验材料 实验四所得的DNA片段，以及用质粒纯化试剂盒提取的高纯度载体质粒pBluescript II(由教师提取)。四、仪器设备 恒温水浴锅 低温恒温水浴锅 电泳仪 电泳槽 紫外透射检测仪 五、实验用具 微量取液器 吸管头若干 微量离心管(1.5 ml，已灭菌)六、试剂 HindIII及10反应缓冲液 无菌双蒸水 碱性磷酸酯酶(CIP) 1 M Tris-HCl (pH9.0) T4 DNA连接酶及10缓冲液(含ATP) 酚:氯仿七、实验步骤 1. 载体的酶切和去磷酸化处理(1) 在离心管中加入5 mg pKS质粒 DNA，10 ml 10 HindIII缓冲液，加双蒸水至98 ml，最后加入20 U HindIII酶。充分混匀，离心30秒，在37恒温水浴锅保温30分钟。(2) 加入5 ml 1M Tris-HCl (pH9.0)，2 U CIP，充分混匀，离心30秒，在37恒温水浴锅保温，60分钟。(加pH9.0的Tris-HCl缓冲液，目的是将pH7.5 8.0的酶切缓冲液的pH值调到适合CIP的pH8.5左右)。(3) 温育结束时，加EDTA (pH 8.0)至终浓度为5 mM，混匀，于65加热60分钟(或于7510分钟)。然后用酚/氯仿抽提两次；上清液加0.1体积3 M醋酸钠，充分混匀，再加2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀后于-20放置15分钟。12000 rpm离心15分钟，沉淀用冷70酒精洗一次，风干后用40 ml TE溶解(DNA浓度约为80100 ng/ml)。 2. 连接 在微量离心管中加入 载体DNA 1 ml (80100ng) 目的片段DNA 50-100 ng ddH2O 加至8ml混匀，45 50，5分钟(使粘性末端分开）加入10T4 DNA连接酶缓冲液1 ml用1连接酶缓冲液将连接酶稀释成0.2 Weiss单位或12 NEB单位/ml再加入已稀释的T4 DNA连接酶1 ml混匀，稍离心，在PCR仪上进行连接反应65，5min，置于4oC保存备用八、注意事项1. 克隆用的载体质粒要求较高纯度，使之能用最少的酶和较短的反应时间达到完全的切断。使用过量的内切酶或CIP以及过长时间的反应会使载体末端缺失，产生大量的假阳性菌落(白色但没有插入子)。2. 使用T4 DNA连接酶之前，应看清楚生产厂家所使用的活性定义单位，以便采用合适的酶浓度反应条件，不致造成不必要的浪费。3. 目的DNA片段与载体DNA之间的摩尔浓度比例一般是3:11:1，并且使反应体系中DNA的总末端浓度适于DNA分子之间连接，但又不易形成多分子连接的寡聚物，造成片段多拷贝插入。九、时间安排 二个下午。实验六 重组DNA的转化一、目的 学习将体外重组DNA(实验五的连接产物)引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中筛选出转化子的常用方法。二、原理 把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化(transformation)。当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最易发生。常用的转化方法是用CaCl2处理受体菌，使细菌细胞进入敏感的感受态。当细菌处于冰冻(0)的CaCl2溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源DNA。在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，载体中抗抗生素基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 本实验所用重组DNA的载体带有E.coli中的b-半乳糖苷酶基因 (LacZ)的调控序列和部分编码序列，编码区内插入了一个多克隆位点，进入宿主菌后可与宿主细胞之间实现a-互补而产生Lac+，在生色底物X-gal存在下形成兰色菌落。如有外源DNA插入到质粒的该位点，则破坏了互补能力，菌落呈白色。三、实验材料 实验五的连接产物(重组DNA)、受体菌(E.coli，DH5a)。四、仪器设备 高压灭菌锅 超净工作台 冷冻高速离心机 恒温水浴锅 冰箱 恒温摇床 恒温培养箱五、实验用具 离心管50 ml1 电炉 试管1 微量取液器 微量离心管 培养皿 冰浴保温瓶 锥形瓶150 ml1 烧杯六、试剂 LB培养基 无菌双蒸水 氨苄青霉素(Amp) 0.1 mol/L CaCl2 SOC培养基 X-gal IPTG七、实验步骤 1 . 感受态细胞的制备挑取E.coli DH5a受体菌单菌落(23 mm)于有50 ml LB培养基的500-ml锥形瓶中。37振荡(250rpm)培养约2.5小时(活细胞数不超过108个/ml)。（以下步骤均在超净工作台操作）超净工作台上，倒入经消毒的50 ml离心管中，盖严。在1L烧杯冰浴中放置10分钟，使菌液冷却至0。4，4000 rpm离心10分钟收集菌体。弃上清液，倒置在纸巾上1分钟。加10 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2 ，悬浮菌体。冰浴25分钟。离心（4，4000 rpm，10分钟）。加入1.5 ml 预冷的0.1 mol/L CaCl2，小心悬浮4冰箱保存过夜(1224小时)。 2 . 转化 在1.5 ml离心管中加入感受态细胞ddH2O连接物载体质粒重组质粒空白对照200 ml2 ml000CK(阴性对照)200 ml001ml (10 ng)0CK(阳性对照)200 ml001 ml(10 ng)自我环化对照200 ml02 ml(不含插入子)00处 理200 ml02 ml00用吸管头温和混匀冰浴30分钟42，静置90秒冰浴23分钟加入800 ml 37预热的SOC液体培养基用1000-ml取液器移至培养管，37摇动（200rpm）45分钟。各取100200 ml涂板，将培养皿置于室温至液体被吸收。倒置培养皿，37培养过夜.观察转化结果(白色为阳性，蓝色为阴性)八、注意事项1. 为了达到较高的转化效率，LB和SOC液体培养基需用进口的胰蛋白胨(Tryptone)和酵母浸出粉（Yeast extract）。2. 转化实验使用的玻璃器皿、微量吸管、离心管管，应彻底洗净并进行高压消毒，表面去污剂、化学试剂的污染将大大降低转化率。微量吸管应剪去尖端扩大口径。3. 制备感受态细胞的培养时间最好以OD值来决定。对某种菌株在培养后不同时间取样测定OD600值，比较不同OD值时细胞的转化效率，以确定对该种菌株的最佳OD值，以后每次实验就以确定的OD值为指标选用细胞培养时间。4. 转化态细胞应尽量保持低温，离心管应提前预冷。5. 受体菌细胞经CaCl2处理后，细胞壁较脆，悬浮时小心操作。6. 制备好的感受态细胞可急冻保存备用：在1L烧杯中装入100ml无水酒精，在-70 -80冰箱预冷。将感受态细胞分装入离心管(0.2 ml/管)，置于-80酒精急冻，并保存在-70 -80冰箱。九、时间安排 实验前一天下午下班前接种划平板。 实验当天上午下班(11:30)前摇菌。实验当天下午约2:00开始制备感受态细胞，配培养基、灭菌、倒平板，第二天下午做转化实验。实验七 重组转化子的快速鉴定一、目的 掌握快速鉴定重组转化子的方法。二、原理 虽然大部分质粒载体都可通过蓝白色选择重组转化子，但在实际应用中往往有相当部分的白色克隆是不含插入子的。本鉴定方法是用碱性裂解液把转化子菌体裂解，然后直接用琼脂糖凝胶分离，通过比较白色和兰色转化子质粒的迁移率，鉴定出重组转化子。三、实验材料：实验六得到的转化子。四、仪器设备：电泳装置。五、实验用具：96孔平板，牙签。六、试剂 含抗生素LB平板 10 mM EDTA (pH8.0) 1 M KCl 10 x载样缓冲液 0.8%琼脂糖凝胶 2碱性裂解液：母液配制50 ml所需的量最终浓度4 M NaOH2.5 ml0.2 M10% SDS2.5 ml0.5 %蔗 糖15 g30%七、 实验步骤 1. 用牙签从转化选择平板选取几十个白色和几个蓝色菌落，殖在LB平板上，37过夜。 2. 在96孔平板每孔加入20 ml 10mM EDTA。 3. 用牙签挑取少量菌体(不能太多)，悬浮于各孔中(其中12孔是蓝色菌落作为对照)，将平板接触旋涡器几秒钟。 4. 加入20 ml裂解液，将平板接触旋涡器几秒钟，静置5分钟。 5. 将等量的1M KCl和载样缓冲液混合，各孔中加入6 ml，将平板接触旋涡器几秒钟。 6. 按蓝色菌落，白色菌落.最后蓝色菌落的顺序，各取2030 ml点样。 7. 电泳，观察。与蓝色菌落质粒迁移率比较，可判别白色菌落的重组质粒是否含有插入子。八、注意事项挑取菌落勿太少，也不能太多。此外，裂解后菌液较粘，点样时吸管头勿垂直拉出以免带出点样孔内的菌液样品。实验八 多聚酶链式反应(PCR)一、目的 了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。二、原理 PCR (Polymerase Chain Reaction)是80年代中发展起来的一种DNA特定片段体外扩增技术。它已广泛应用于基因克隆、文库构建、DNA序列分析、生化检测、基因定位等领域。最初PCR是用E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段进行，但Klenow片段高温下迅速失活，因此每一轮反应都需要加一份新酶，这不仅麻烦，还往往导致产量低，产物长短不一等现象。随后，从噬热细菌(Thermas aquaticus)中分离到热稳定的Taq聚合酶，才解决了这一问题。由于Taq DNA聚合酶高温下稳定，在整个扩增过程中不需要添加新的酶，从而保证了PCR技术的实用性，使其得以迅速发展。 PCR的原理及过程如下: (1) 将反应体系(模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4种dNTP和Taq DNA聚合酶)置于高温(94)下变性，使模板双链DNA解链为两条单链；(2) 在低温(3765)下退火，使引物与模板链3端结合，形成部分双链DNA；(3) 在中温(72)下，通过Taq DNA聚合酶使引物从5端向3端延伸，随着4种dNTP的掺入合成新的DNA互补链，完成第一轮变性、退火和聚合反应循环。反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增(见附图)。循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个目的DNA分子经20轮扩增后，可达106。三、实验材料 重组质粒DNA。四、仪器设备 DNA热循环仪 电泳仪 电泳槽 紫外检测仪 台式离心机五、实验用具 0.5ml离心管10个 吸管头若干个 微量取液器(20 ml)一支 1.5ml离心管20个 离心管架两个六、试剂 1. 反应缓冲液：由Taq酶供应厂商提供。 2. 四种核苷酸混合物(dNTPs)：浓度为2 mM。 3. 寡核苷酸(PCR引物)：上游引物和下游引物(一般长度为1720个核苷酸)。 4. Taq DNA聚合酶 5. 1.2% 琼脂糖凝胶七、实验步骤 1. 模板DNA的抽提：按碱裂解法抽提得到质粒DNA。 2. PCR操作： (1) PCR反应混合液的配制 （n为反应数）： n x 2.0 ml反应缓冲液(含15 mM MgCl2) n x 1.0 ml dNTPs (2 mM) n x 1.0 ml上游引物(5 mM) （引物在反应液中的浓度通常为0.20.5mM） n x 1.0 ml下游引物(5 mM) n x 0.50.8单位Taq酶 加无菌水至总体积 n x 19 ml 每个PCR管中加入19 ml反应混合液，1 ml稀释质粒DNA（2 ng），再加2滴矿物油，防止水分蒸发。稍离心。 含有重组质粒的菌体也可直接用于PCR扩增：用牙签点取少量菌体在空的PCR管底部插几下，加入反应混合液和滴矿物油即可。注意：菌体不可太多，太多的菌体(即杂质)会抑制Taq酶的活性。(2) PCR反应过程：94，1分钟(预变性，可用STOP键或Pause键进行) 94，30秒 55，1分钟 35个循环 72，2分钟 72，5分钟 3. PCR产物的检测：取5 ml PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳，然后放在紫外检测仪下观察，记录结果。八、注意事项 由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕迹量DNA的污染。因而在实验中应注意下列事项： 1. 所有的与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。 2. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。4. 特别注意防止引物受到用同一引物扩增的DNA的污染。应从引物母液中取一小部分稀释成工作液作平常用，以避免污染引物母液。九、时间安排一个下午；PCR产物电泳检测时，进行植物DNA的抽提。实验九 植物DNA的抽提一、目的 掌握总DNA的抽提方法和原理。二、原理 植物的各个部位都可用作总DNA的抽提材料，但常用的材料为植物叶片和幼苗。为了获得高纯度的DNA，用作抽提材料的植物幼苗，最好先在黑暗的条件下放置几天，以消除叶绿素的影响。 植物总DNA的抽提方法有多种，不同的植物都有最合适的抽提方法。但各种方法的基本原理都一样，其原理是先用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadeyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称为SDS)等离子型表面活性剂，溶解细胞膜和核膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂，进入细胞核内的表面活性剂解聚核中的核蛋白(并与蛋白质形成混合物)；再加入酚和氯仿等表面活性剂，使蛋白变性；经离心除去植物的组织和变性蛋白；上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀；沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。三、实验材料：水稻叶片等植物材料。四、仪器设备 高速冷冻离心机 电泳装置2套 液氮罐 高速台式离心机 振荡器1台五、实验用具 1.5毫升离心管架1个 7毫升离心管架1个 50ml离心管架1个 玻璃滴管5支 研钵一套 纱布 离心管50 ml10、7 ml10、1.5 ml10 (离心管、吸头及玻璃滴管均需消毒)六、试剂 无水乙醇, 70%乙醇 氯仿 琼脂糖 TBE电泳缓冲液 TE缓冲液(pH 8.0) 10 mg/ml的RNase溶液 3 M乙酸钠(NaAc) 限制性内切酶(Pst I 或EcoR I) 抽提缓冲液(配制1升)： 母 液配制1升所需的量最终浓度 5 M NaCl 100 ml500 mM1 M Tris-HCl(pH 8.0) 100 ml100 mM500 mM EDTA(pH 8.0) 100 ml50 mM 20% SDS 62.5 ml1.25%(W/V) ddH2O637.5 ml七、实验步骤 1. 将水稻叶片约56 g，放入预冷的研钵中，加入液氮，将叶片研磨成粉状；将粉末倒入50 ml离心管中。注意：动作迅速，不要让粉末解冻。 2. 加入25毫升在65水浴中预热的抽提缓冲液，混匀，放入65水浴中保温2030分钟 (期间每隔5分钟轻轻摇动一次离心管)。 3. 加入15 ml氯仿，混匀后，平放在振荡器上摇动10分钟（振荡频率以抽提液与氯仿完全混合为度）。 4. 离心15分钟（4000 rpm、20），将上清液经纱布过滤倒入另一50 ml离心管。 5. 加入2倍体积的冷冻无水乙醇，轻轻混匀，在-20冰箱中放置1小时。 6. 用玻璃滴管将DNA挑出，并用5ml的70的乙醇冲洗，在干净的吸水纸上吸干后放入1个7 ml离心管中，加入2 ml TE缓冲液，60下保温并间或轻摇直至DNA溶解。 7. 加2 ml RNA酶，室温下放置15分钟，然后4000 rpm离心15分钟除去不溶的物质。 8. 上清液倒入另一个7 ml离心管，加入1/10体积3 M乙酸钠和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20冰箱放置2小时。 9. 用玻璃滴管挑出DNA，用5ml 70的酒精漂洗，在干净的吸水纸上吸干后放入1个1.5 ml离心管中，加入0.5 ml TE，60下保温并间或轻摇直至DNA溶解。 10. 10000 rpm离心10分钟，除去不溶解的物质，上清液倒入另一个1.5 ml离心管中。 11. 取4 ml溶液在0.8%琼脂糖凝胶中电泳，电泳完后在EB中染色，并在紫外检测仪下观察，检测DNA的质量和估计DNA的浓度。 12. 酶解。基本方法同实验三，但对基因组DNA，内切酶用量要增多，酶切时间应延长，可按23单位/mg DNA的酶用量计算，酶切反应应于37下进行16小时。八、实验的关键和注意事项 1. 由于植物细胞中含大量DNA酶，因此除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。 2. 材料量不能太多，不能超过5 g，氯仿的加入量不能太少，否则蛋白质变性不完全。 3. 如果第四步时，上清液颜色太浓或混浊，说明还有大量的蛋白质未除去，应再用15 ml氯仿处理一次。九、时间安排二个下午。附：CTAB提取法 CTAB提取法是使用比较广的方法，其优点是提取的DNA纯度较高，多糖类物质的混杂较少，酶切较完全。一、试剂 (1) 1.5CTAB提取液：1.5%(W/V) CTAB(Hexadecyltrimethylammonium bromide)，75mMTris-HCl pH8.0，1 M NaCl，15mM EDTA。 (2) 10% CTAB 溶液：10 CTAB (3) 沉淀液：1%CTAB，50mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTA (4) 氯仿/异戊醇(24:1) (5) 高盐TE： 1M NaCl，10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA (6) 其余：无水乙醇；70% 乙醇；TE；10mg/ml RNAase A二、方法 (约58 g水稻叶材料/管为例，如材料较少时可适当减少提取液及氯仿的使用量)1. 将冷冻材料研磨成粉末，移入50ml离心管。加入20ml的CTAB提取液(可预热到80), 摇匀。在56 水浴中保温15-20分钟，并经常拿出来摇几下。2. 加入15 ml 氯仿，混匀后，平放在振荡器上摇动10分钟（振荡频率以抽提液与氯仿完全混合为度）。离心15分钟 (4000rpm，20)3. 移上清液至另一离心管，加入1/10量的10%CTAB液