《色谱法基本原理》PPT课件.ppt

第二章色谱基本原理 2 1概论2 2色谱分配平衡2 3塔板理论2 4速率理论2 5影响谱带扩宽的其他因素2 6分离度及其影响因素2 7分析时间的最佳化 2 1概论 2 1 1色谱基本流程 流动相 进样器 流速控制与测量 色谱柱 检测器 数据记录与处理系统 2 1 2色谱流出曲线及常用的术语和参数 色谱流出曲线 色谱图 指色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间的曲线图称色谱流出曲线 2 1 2色谱流出曲线及常用的术语和参数 1 基线 实验条件下 只有纯流动相通过检测器时的记录信号 基线稳定 基线漂移 基线 低频 噪声 基线 高频 噪声 2 色谱带 组分在柱内的浓度分布构型 3 色谱峰 组分通过检测器产生的响应信号记录的微分曲线 4 峰高 色谱峰顶到基线的垂直距离 4 保留值 组分在色谱床中的滞留情况 用时间表示 保留时间tR死时间tM调整保留时间 用体积表示 死体积 保留体积 调整保留体积 室温下 皂膜流量计测得的流速 大气压 柱出口的压力 室温时水的饱和水蒸气压 柱温 室温 校正保留体积 柱内平均压力下的平均流速乘以保留时间所得到的体积 j 压力校正因子 式中 为大气压 为柱前压力 净保留体积 比保留体积 指时每克固定液的净保留体积 式中 为柱温 为固定液重量 相对保留值r2 1 两个不同组分的调整保留值之比 6 区域宽度 色谱峰的宽度 标准偏差 0 607倍峰高处色谱峰宽度的一半半峰宽 峰底宽度 2 2色谱的平衡 2 2 1分配系数与柱温的关系 在一定温度下 分配体系达到平衡时 组分在两相的浓度之比称为分配系数K K由组分和两相的热力学性质决定 随柱温而变化 当色谱体系和分离对象确定以后 K只与柱温有关 其关系式为 一般情况组分在固定相的为负值 则与成反比 2 2 2分配比 分配容量 容量因子 容量比 指在一定的柱温下 组分在两相达到分配平衡时 分配在固定相和流动相的总量之比 式中 称为色谱体系相比 注意 1是指真正参与组分在两相分配的那一部分有效体积分配色谱 固定液的体积吸附色谱 吸附剂表面积离子交换色谱 离子交换剂的交换容量排阻色谱 多孔固定相孔容2为柱内流动相的体积 柱死体积 流动流动相 停滞流动相 实际测定时包括了进样器 连接管 检测器的死体积 2 2 3分离因子 选择比 溶剂效率 对一定色谱柱 两相的体积比一定 则 不同浓度溶液中溶质迁移所引起的自由能变化 对组分1和组分2有 两组分自由能变化的差值应为 当时 组分不能分离 主要由两相的性质决定 同时也会受柱温的影响 与柱长 柱径 流动相速度 柱填充情况无关 2 2 4分配等温线 分配系数随组分浓度变化的规律称为分配等温线 典型的分配等温线有三种 线性 凸型 凹型 a b c k与C无关 C增大 K减小 C增大 K增大 2 2 5基本保留方程式 组分在柱内的移动速度取决于组分在两相中的分配 组分在固定相时 迁移速度组分在流动相时 迁移速度所以 有保留组分谱带的迁移速度 设色谱柱长对于溶质分子 对于流动相分子 可从色谱图直接测定 若用保留体积代替 则 因为 基本保留方程式 所以 因为保留值与 有关 装置改变时保留值不同 色谱基本保留方程式的物理意义 组分的保留值取决于组分的K和色谱体系的 色谱装置 VM与Vs 一定时 相比 一定 组分保留值取决于K 组分的本性 故可作为定性的依据 色谱流出曲线的意义 色谱峰数 样品中组份的最少个数 色谱保留值 色谱峰高或面积 色谱保留值或区域宽度 色谱柱分离效能评价指标 色谱峰间距 固定相或流动相选择是否合适的依据 定性依据 定量依据 例1 在某色谱分析中得到下列数据 保留时间 tR 为5 0min 死时间 tm 为1 0min 液相体积 VS 为2 0mL 柱出口载气体积流速 FO 为50mL min 试计算 1 保留因子k 2 死体积Vm 3 分配系数K 4 保留体积VR 解 1 k tR tm 5 0 1 0 1 0 4 0 2 Vm FOtm 50 1 0 50mL 3 K kVm VS 4 0 50 2 0 100 4 VR FOtR 50 5 0 250mL 2 3塔板理论 platetheory 1941年 马丁等人提出了塔板理论 把色谱分离过程比作分馏过程 把色谱柱比作一个分馏塔 并作了四个理想的假设 2流动相从柱入口每次以一个的体积不连续进入 3组分的在所有的塔板上均为常数 4忽略塔板间的纵向分子扩散 1在柱内一小段长度H内 组分在两相瞬间达到分配平衡 这一小段柱称为一个 理论塔板 它的长度称为理论塔板高度 K 根据以上假定的条件 讨论组分在两相间的移动分配过程 假设 2 加入柱内的流动相脉冲塔板数N 1 色谱由5块理论塔板组成 塔板号r 0 1 2 3 4 3 当加入一个塔板体积脉冲流动相到0号塔板时 原来塔板中流动相中的组分就依次冲到下一个塔板 并在两相间重新分配并达到平衡 4 塔板上流动相的组分数为q 固定相中的组分数为p 经过N次转移后 分配在各塔板上的组分数符合二项式分布 p q N p和q可以从组分的分配比来计算确定 若组分A的kA 2 0 p 0 667 q 0 333 组分B的kB 0 5 p 0 333 q 0 667 经过4次转移以后 各塔板上A B组分的含量符合由二项式展开后所得的各项值 p q 4 p4 4qp3 6q2p2 4q3p q4A组分 0 333 0 667 4 0 198 0 395 0 296 0 0990 0 0120 1 000B组分 0 667 0 333 4 0 0124 0 0990 0 296 0 395 0 198 1 000 A B组分在柱内各塔板中的浓度分布见表3 1 N 0 组分加到0号塔板上 平衡时 N 1 进1 V载气 平衡时 0 25 N 2 进2 V载气 0 125 平衡时 N 3 进3 V载气 平衡时 0 063 N 4 进4 V载气 平衡时 0 032 0 125 N 5 进5 V载气 平衡时 0 032 N 6 进6 V载气 平衡时 N 7 进7 V载气 平衡时 以组分数在柱出口出现的分数为纵坐标 流动相板体积N为横坐标作图 就得到色谱流出的曲线 当理论塔板数N 50时 就可以得到较理想的对称峰形 GC N 103 106 流出曲线趋于正态分布曲线 色谱峰为正态分布时 色谱流出曲线的浓度变化方程 m为组分质量 VR为保留体积 N为理论塔板数 当流动相体积V VR时 C值最大 即 当VR V 1 2W1 2时 式中N为理论塔板数 W1 2 分别以体积 时间为单位的色谱峰半高宽度 由塔板理论可以导出理论塔板数n的计算公式 式中 tR 的单位必须相同 对于长度为L的色谱柱 理论塔板高度为 由于柱内的死体积Vm 或tm 不反映出各组分与固定相相互作用的本质 在考虑实际柱能时 应扣除死保留值 以有效塔板数neff作为衡量柱效能的指标 则 上式可以看出 都随 值变化 很小时 和 使用不同的 值的组分 测出的柱效是不同的 2 4速率理论 ratetheory 速率理论首先由荷兰学者VanDeemter等提出 导出气相色谱速率方程 称为VanDeemter方程 后来美国科学家J CalvinGiddings提出了随机行走的紊流理论模型 并对速率方程式提出补充 进一步提出了液相色谱速率理论方程式 2 4 1紊流模型 RandomWalk 紊流模型的理论要点 组分分子随流动相通过色谱床时 沿着流动相的方向在一维空间内进行无规则的运动 组分分子随机的向前走 平均步长 相当于塔板高度H 行走步数 相当于理论塔板数 行走距离L 相当于色谱柱长 多个分子如此随机行走 导致谱带扩宽 扩宽的程度可用正态分布标准偏差来表示 谱带宽度 色谱柱长可以理解为步数 和平均步长 的乘积 令步长 步数 则 H的物理意义 单位柱长色谱峰展宽的程度 色谱柱总塔板高度等于各个独立影响因素对板高贡献之和 2 4 2广范围的VanDeemter方程式 1 涡流扩散 eddydiffusion 涡流扩散纯属流动状况造成涡流扩散动画单位柱长对峰宽的影响为式中 填充颗粒的平均直径填充因子 与dp粒度范围和填充情况有关高效率柱 采用200 400目粒度范围颗粒 2 纵向扩散纵向扩散是分子的无规则热运动引起的 所以也称为分子扩散 分子扩散动画式中 弯曲因子 也称为障碍因子 与填充材料的几何形状有关 Dm 组分在流动相中的扩散系数 与组分的性质 柱温 压力 流动相性质有关 流动相的平均线速度LC 液体没有压缩性 柱内线速度是均匀的GC 气体可压缩 柱内压力从入口到出口递降 载气线速度从入口到出口递升 uo 柱出口流速 3 固定相中的传质阻力 Resistancetomasstramsferinstationaryphose 溶质由流动相扩散到固定相 在固定相中溶质要达到平衡时所遇到的阻力 峰扩展原因 同一组分的分子进出固定相的速度不同液相固定相 由于分子扩散到固定相不同的深度吸附色谱 吸附剂表面的活性不同 式中 构型因子 取决于固定相的构型 均匀液膜 离子交换树脂固定相 液膜 的平均厚度 小 有利于迅速建立平衡 柱效高过小 最大允许进样量小 载体表面的吸附中心暴露 导致峰拖尾溶质在固定相中的扩散系数 纸 3 流动相中的传质阻力 Resistamcetomasstramsferinmobilephase 组分从流动相的主体扩散到流动相与固定相的界面进行质量交换 妨碍这一扩散过程的阻力称为流动相传质阻力 a 流动的流动相中的传质阻力 不同分子与固定相表面的距离不一 到达表面所需要的时间不同 对于气相填充柱色谱 对于液相色谱 式中 无纲量常数 或称为柱因子 b 停滞流动相中的传质阻力存在于颗粒内部孔隙中的流动相 不随主体流动 故称为停滞流动相 式中 与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及与容量因子有关的常数 联合上述四项影响色谱区带宽化的因素 对于气 液色谱 不存在 则 GC 溶质在气相流动相中传质快 流动相传质阻力可以忽略 一般采用只有三项的简化VanDeamter方程式 上两式均称为速率理论方程式 可以简写为 2 4 3速率理论方程式的偶合式 Giddings以严格的科学方法证明影响塔板高度的各种因素不是独立 而是相互关联的 涡流扩散和流动相传质效应相互偶合形成偶合涡流扩散项Hem 2 4 4速率理论方程式的讨论 1 流速对塔板高度H的影响 曲线的最低点H最小 以Hmin表示 柱效能最高 该点对应的流速称为最佳流速 GC曲线与LC曲线不同的原因 Dm大 当 低时 分子扩散项 影响显著 2 固定相颗粒 的影响 2 5影响谱带扩宽的其他因素 1 非线性色谱速率理论假定分配等温线是线性的 在实际工作中 经常遇到的是非线性等温线 2 活性中心的影响载体或吸附剂表面的活性中心对组分的吸附力太强 使组分迟迟不得释放而造成拖尾 解决办法 将载体进行预处理 去除表面的活性中心 在LC中 在流动相中加入缓和剂 3 柱外效应进样的方式和进样技术 以及进样器 检测器 连接管的死体积造成的谱带扩宽 称为柱外效应 柱外效应常用柱外效应引起峰体积的相对增大值作为度量指标 峰体积 柱内宽化服从速率理论方程柱外某连接管溶质的宽化为 式中 d 连接管内径 0 25 0 3mm L 连接管的长度流动相体积流速 死体积愈小 柱外宽化愈小 一般控制不超过总宽化的10 影响谱带扩展的各种因素为 四种动力学因素 涡流系数 纵向分子扩散 固定相传质阻力 流动相传质阻力 其他 非线性等温 活性中心 死体积 进样管连接管检测器 其他 进样技术气化温度 2 6分离度及其影响因素 2 6 1分离度的定义 色谱分离的三种情况 实现分离的条件 峰间距 峰宽 柱效能增大 峰宽减小 全面反映两峰分离程度的参数 分离度R 相邻两峰保留时间之差与两组分色谱峰的峰底宽度之和的一半的比值称为分离度R 对于对称的高斯峰 R 0 8时 分离程度89 一般采用R 1 5作为相邻两峰完全分离的标志 2 6 2基本分离方程式 上式称为基本分离方程式 是色谱分析中最重要的方程式之一 可以计算给定体系所能达到的分离度和达到某一分离度所需的色谱柱长 2 6 3影响分离度的因素 1 色谱柱效n 增加n的方法 降低H 制备性能优良的柱子 在最优化的条件下操作 增加柱长 若系统压力不变 则必须降低流速 若分析时间不变 则必须增大柱压 对设备要求提高 2 相对保留值a 增大 柱选择性提高 R增大 从1 01 1 1 增加9 R增加9倍 从1 5 2 0 增加33 R增加1 5倍 1 改变 R增大 较大时 对R的影响小 1 2已足够 若要达到一定的分离度 在k不变的情况下 的微小增加 将使n显著下降 R n 改变 的方法 GC 固定相 柱温 LC 固定相 流动相 3 分配比k 即分离度正比于溶质在固定相中所占的分数 总的说 k增大 R增大 当k很小时 随k增大 R增大 k 5以后 k增大 R的增加缓慢 k 10后 增大k对R的改进不明显 反而使 改变k的方法 改变固定相 改变柱温 GC 或流动相 LC 改变相比 改变VS及柱死体积Vm n k对R的影响可用下图表示 改变k对分离产生很大的影响 若原始k 0 5 2 k减小 tR减小 R减小 k增大 R增大 峰高降低 峰宽增大 若柱长不变下增加n tR不变 峰高增高 峰宽减小 R增大 增加a 两峰发生相对位移 R增大 为了用量的概念讨论多组分分析 Giddings引入了峰容量的概念 峰容量 在给定色谱条件 柱系统 柱温 流两相 下 和一定时间内所能容纳的一定分离度的色谱峰个数 若所有峰的分离度均等于1 以死时间开始计算色谱峰个数 最后一个峰的峰尖作为末端时间 则 提高柱效n和最后一个组分的容量因子kmax均可增大峰容量 实现多组分分离 2 7分析时间的最佳化 2 7 1影响分析时间的因素 基本保留方程式 讨论 1 分析时间是分离度和分离条件的函数R从12 tR变为原来的四倍 若k不影响其它变量 则k在1 5之间变化 分析时间变化很小 实际上 k影响n值 即H与k有关k的最佳范围在1 5 4之间 对于一定的色谱柱 两相 k n一定 2 7 2分离与分析时间的最佳化 单位时间有效塔板数 表 气相色谱与液相色谱的 值