PCR技术及注意事项.ppt

PCR技术应用及注意事项 威斯腾生物技术中心TEL 40067567582014 9 1 PCR 聚合酶链式反应 PolymeraseChainReaction 是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术 1971Khorana等最早提出核酸体外扩增的设想 1983年Mullis发明并申请专利 背景 根据DNA的半保留复制 原理 双链DNA单链复制两分子拷贝 在体外实验中 DNA在高温时也可以发生变性解链 当温度降低后又可以复性成为双链 因此 通过温度变化控制DNA的变性和复性 加入设计引物 DNA聚合酶 dNTP就可以完成特定基因的体外复制 缓冲液4种dNTP混合物 终浓度 引物 终浓度 模板DNATaqDNA聚合酶 耐热DNA聚合酶 Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义 该酶可以耐受90 以上的高温而不失活 不需要每个循环加酶 使PCR技术变得非常简捷 同时也大大降低了成本 Mg2 终浓度 双蒸水 反应体系 变性 退火 延伸三个基本反应步骤构成 模板DNA的变性 模板DNA经加热至93 左右一定时间后 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 使之成为单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 模板DNA与引物的退火 复性 模板DNA经加热变性成单链后 温度降至55 左右 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 引物的延伸 DNA模板 引物结合物在72 DNA聚合酶 如TaqDNA聚合酶 的作用下 以dNTP为反应原料 靶序列为模板 按碱基互补配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链 重复循环变性 退火 延伸三过程就可获得更多的 半保留复制链 而且这种新链又可成为下次循环的模板 每完成一个循环需2 4分钟 2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 步骤 RT PCR 首先提起RNA 然后用逆转录酶与mRNA为模板进行cDNA第一链的合成 然后的原理和PCR就一样了 RT PCR是个半定量的实验 可以确定在mRNA水平的表达差异 免疫PCR immunopolymerasechainreaction IPCR 原理 是用一段已知DNA分子标记抗体作为探针 用此探针与待测抗原反应 PCR扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子 电泳定性 根据特异性PCR产物的有无 来判断待测抗原是否存在 巢式PCR 是用内外两对引物扩增拷贝数较低的片段 先用外引物进行第一轮反应 将产物适当的稀释 然后用内引物继续扩增 比较适合微量DNA或者石蜡组织抽提的DNA 分类 原位PCR技术 原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应 它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点 是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术 实时荧光PCR 利用荧光来检测PCR产物 PCR每循环一次就收集一个数据 通过实时扩增曲线 准确确定CT值 从而确定DNA拷贝数 除此之外 还有锚定PCR 反向PCR 不对称PCR 长距离PCR 降落伞PCR 梯度PCR等30几种PCR 分类 模板 避免污染 提高质量 浓度适宜 25 100ng 浓度过高增加非特异性 浓度过低会降低扩增效率 使PCR产物量少 注意事项 引物 设计得当 特异性高 长度 15 30bp碱基 G C含量以40 60 为宜 G C太少扩增效果不佳 G C过多易出现非特异条带 ATGC最好随机分布 避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补 特别是3 端的互补 否则会形成引物二聚体 产生非特异的扩增条带 引物3 端的碱基 特别是最末及倒数第二个碱基 应严格要求配对 以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败 引物的特异性 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 尤其避免错配 引物量 每条引物的浓度0 1 1umol或10 100pmol 以最低引物量产生所需要的结果为好 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增 且可增加引物之间形成二聚体的机会 必要时 引物上可以加入合适的酶切位点 有利于分子克隆 dNTP 多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中 dNTP应为50 200umol L 浓度过低会降低PCR产物的产量 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等 等摩尔配制 如其中任何一种浓度不同于其它几种时 偏高或偏低 就会引起错配 Taq酶 扩增产物随酶用量的增加 呈增多的趋势 浓度在10 15U效果较好 若太高 则降低扩增的特异性 若太低 则会影响PCR扩增反应 Mg2 作用是1 促进polymerase的活性 2 核苷酸进入聚合酶的活性中心也需要镁离子来消除dna骨架上磷酸基团的负电荷 浓度过高可降低PCR扩增的特异性 浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带 温度 变性温度 达不到变性温度就不会产生单链DNA模板 PCR也就不会启动 变性温度低则变性不完全 DNA双链会很快复性 因而减少产量 一般取90 95 样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度 DNA变性只需要几秒种 时间过久没有必要 反之 在高温时间应尽量缩短 以保持TaqDNA聚合酶的活力 加入TaqDNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95 退火温度 温度高特异性强 但过高则引物不能与模板牢固结合 DNA扩增效率下降 温度低产量高 但过低可造成引物与模板错配 非特异性产物增加 一般先由37 反应条件开始 设置一系列对照反应 以确定某一特定反应的最适退火温度 延伸温度 引物延伸温度温度的选择取决于TaqDNA聚合酶的最适温度 一般取70 75 在72 时酶催化核苷酸的标准速率可达35 100个核苷酸 秒 每分钟可延伸1kb的长度 其速度取决于缓冲溶液的组成 pH值 盐浓度与DNA模板的性质 循环数 循环数过少 PCR产物得率低 循环数过多 增加非特异性 循环次数常规PCR一般为25 40个周期 在保证产物得率前提下 应尽量减少循环次数 Real timeQuantitativePCRDetectingSystem QPCR 实时检测 在对数扩增时期 而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高 Taqman 精确定量 Real timeqPCR和常规PCR的区别 基线 BaseLine 指在PCR扩增反应的最初几个循环里 荧光信号变化不大 接近于一条直线 这样的直线 即是基线 荧光域值 threshold 一般是指PCR反应的前15个循环的荧光信号 这是作为荧光本底信号 荧光域值的缺省设置是3 15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 设定在PCR扩增的指数期 Ct值 是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 Ct值与起始模板的关系 研究表明 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 起始拷贝数越多 Ct值越小 扩增曲线 在PCR过程中 以循环数为横坐标 实时荧光信号强度为纵坐标所做的曲线 该技术以美国ABI公司为代表 PCR扩增时 在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针 该探针为一直线型的寡核苷酸 两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团 探针完整时 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 PCR仪检测不到荧光信号 PCR扩增时 在延伸阶段 Taq酶的5 3 外切酶活性将探针酶切降解 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离 从而荧光监测系统可接收到荧光信号 即每扩增一条DNA链 就有一个荧光分子形成 实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步 这也是定量的基础所在 Taqman技术 TaqMan引物 探针设计 首先选择探针序列探针的Tm值为68 70度 长度不应超过30碱基探针的5 端不应是G G有可能会淬灭荧光素引物应尽量靠近探针 扩增片断不超过400bp 通常为80 150bp引物的Tm值为59 60度 长度约20碱基避免引物 探针之间的二级结构 该技术以美国人Tagyi为代表 也是加入了荧光探针 但它是环状的寡核苷酸探针 分别由茎部和环部组成 两端分别标记荧光报告基团和荧光猝灭基团 在无靶序列的情况下 探针始终是环状 报告基团的荧光被猝灭基团猝灭 使荧光检测仪检测不到荧光信号 而在有靶序列时 即在PCR的退火阶段探针与靶序列结合 使荧光报告基团和猝灭基团分开 这样荧光仪可以检测到荧光 荧光信号的强弱代表了靶序列的多少 Beacon技术 上两种方法特异性强 但是成本较高 探针设计要求较高 SYBR Green是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料 与双链DNA结合后 其荧光大大增强 SYBR Green 从实验成本来讲 SybrGreen是最好的 基本上就是普通PCR加上SybrGreenI荧光染料即可 其信号强度也很好 还可以进行融解曲线分析等 但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测 另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果 当然也有一些技术解决这些问题 对于研究人员来讲 如果需要检测的基因很多 而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求 则SybrGreen是最好的选择 溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物 包括非特异性产物 扩增反应完成后 通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线 随着反应中双链DNA变性 荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低 用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图 在扩增产物的溶解温度上有一特征峰 Tm DNA双链解链50 的温度 用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开 因为它们在不同的温度溶解 这个一般是用SYBYGreen作为荧光染料的时候需要做的工作 溶解曲线 1 无Ct值出现检测荧光信号的步骤有误 一般SG法采用72 延伸时采集 Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号 引物或探针降解 可通过PAGE电泳检测其完整性 模板量不足 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起 模板降解 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况 QPCR常见问题分析 2 Ct值出现过晚 Ct 38 扩增效率低 反应条件不够优化 设计更好的引物或探针 改用三步法进行反应 适当降低退火温度 增加镁离子浓度等 PCR各种反应成分的降解或加样量的不足 PCR产物太长 一般采用80 150bp的产物长度 QPCR常见问题分析 3 标准曲线线性关系不佳加样存在误差 使得标准品不呈梯度 标准品出现降解 应避免标准品反复冻融 或重新制备并稀释标准品 引物或探针不佳 重新设计更好的引物和探针 模板中存在抑制物 或模板浓度过高 QPCR常见问题分析 4 负对照有信号引物设计不够优化 应避免引物二聚体和发夹结构的出现 引物浓度不佳 适当降低引物的浓度 并注意上下游引物的浓度配比 镁离子浓度过高 适当降低镁离子浓度 或选择更合适的mix试剂盒 模板有基因组的污染 RNA提取过程中避免基因组DNA的引入 或通过引物设计避免非特异扩增 QPCR常见问题分析 5 溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化 应避免引物二聚体和发夹结构的出现 引物浓度不佳 适当降低引物的浓度 并注意上下游引物的浓度配比 镁离子浓度过高 适当降低镁离子浓度 或选择更合适的mix试剂盒 模板有基因组的污染 RNA提取过程中避免基因组DNA的引入 或通过引物设计避免非特异扩增 QPCR常见问题分析 6 扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解 反应条件不够优化 可适当降低退火温度或改为三步扩增法 反应体系中有PCR反应抑制物 一般是加入模板时所引入 应先把模板适度稀释 再加入反应体系中 减少抑制物的影响 QPCR常见问题分析 7 扩增曲线的异常 比如 S 型曲线 参比染料设定不正确 MasterMix不加参比染料时 选NONE 模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解 QPCR常见问题分析 Thankyou