NGS中的CTC和ctDNA.ppt

循环肿瘤细胞 Circulatingtumorcells CTCs 目录 CTCs的应用与研究进展 概念 Circulatingtumorcells CTCs arecellsthathaveshedintothevasculaturefromaprimarytumorandcirculateinthebloodstream 2005年Pachmann将CTCs正式定义为自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞 概念 恶性肿瘤是我国死亡率最高的重大疾病之一 90 以上肿瘤患者的死亡都是由于肿瘤转移所致 侵袭与转移是恶性肿瘤最显著的特征之一 CTCs是肿瘤转移过程中在血液循环系统中存活的肿瘤细胞 它的生成被认为是肿瘤发生转移的必要前提 特点 研究意义 研究难点 CTCs并没有显著的特异性同其它血细胞明确区分且不同组织学类型和分子表型的肿瘤分别表达不同的标志物 CTCs在外周血中数量稀少 一般在106 107个白细胞中仅含有1个 无显著特异性 数量少 CTC分析的三个主要步骤 非特异性富集方法 特异性富集方法 方法 CTCs的富集 密度梯度离心富集法 细胞大小富集法 细胞变形性富集法 细胞电学特征富集法 Ficoll法和Oncoquick法 上皮肿瘤细胞大小分离 ISET 和微滤芯片技术 双向电泳 场流分离法 DEP FFF 磁性活细胞分选法 MACS AdnaTest法 Cellsearch法 CTCs的富集 CTCs细胞大小富集方法 Usingsize basedenrichmenttechniques dilutedwholebloodispassedthroughafiltrationdevicewithspecificsizedpores typically8 m CTCsarecapturedbasedondifferencesincellsizebetweenCTCs typically 8 m andwhitebloodcells WBCs typically 8 m Scanningelectronmicroscopy SEM imagesof A commercialtrack etchedmembranes Therandomdistributionofporesresultsintheformationoflargerholesbyfusionofneighboringholes B Amicrofabricatedholeinaparylenemembranefilter C Capturedcellsonaparylenemembranewithcontrolleddistributionandsizeofholes D SEMviewofacapturedCTC Track etchedpolycarbonatefilters Schematicofapool damchip ThedecreasingwidthofgapsbetweensuccessivepoolsallowstheseparationofCTCsinthefirstpool followedbyWBCsandRBCsinthesubsequentpools B Schematicofarraysofobstacleswithsuccessivelydecreasingdistances LargerCTCsaretrappedbetweentheobstacles whilesmallerbloodcellsmovefreely Microfluidicsetting C Isolationofcancercellsbycrescent shapedtraps Thedistancebetweeneachofthethreemicropillarsis5 mwhichpresumablyresultsinthecaptureoflargercancercellsandnotbloodcells Density basedenrichmentutilizesFicoll orsimilardensitygradientmedium toenrichformononuclearcells includingCTCs fromotherbloodcomponents CTCs密度梯度离心富集法 Plasma 血浆Mononuclearcell 单核细胞 包括淋巴细胞 单核细胞 上皮细胞和肿瘤细胞 Ficoll 密度梯度液RBCs 红细胞 TheDEP G FFFprincipleforcellseparation DifferentcellsarelevitatedatdifferentheightsdeterminedbythecollectiveeffectofDEPandgravity FDEPzandFgrav Aftercellsreachtheirequilibriums aparaboliclaminarflowhavingdifferentvelocityprofilesatdifferentheights VFFF2NVFFF1 collectsthecellsatthesameoutputbutatdifferenttimes Cellswithinthefasterprofile VFFF2 arecollectedfirst followedbythecellsliewithintheslowerprofile VFFF1 细胞电学特征富集法 Immunomagneticseparationinvolvestheuseofiron conjugatedantibodiestargetedtowardCTCs e g EpCAM positiveselection orcontaminatingbloodcells e g CD45 negativeselection andincubationinamagneticfield CTCs免疫磁珠富集法 CTCs微流体技术富集法 wholebloodisslowlypassedacrossachip basedsurfaceandisolatedusingeitherCTCtargetedantibody coatedmicropostsordielectrophoresis DEP CTCs各种富集方法的优缺点 CTCs的富集 CTCs的检测 CTCs部分检测方法 CTCs的检测 流式细胞仪分析 flowcytometryFCM 免疫细胞化学技术ICC immunocytochemistry 鉴定标本中细胞抗原性和形态学特征 能使富集的目的细胞维持细胞形态并保持细胞活力 ICC是用能与显色剂结合的单抗与CTCs特异性结合后 通过显色剂显色从而对CTCs进行鉴定的技术 通过分析上皮细胞或肿瘤细胞的正常起源组织特异的候选基因的表达来检测CTC 灵敏度非常高但是坏死的癌细胞 上皮细胞污染等都可以造成假阳性结果 此法无法检测CTCs细胞形态 在临床应用上有局限性 CTCs富集和检测相结合的技术 CTC的研发趋势 CTC CTM CTMarecomposedofatleasttwotumorcells andoccasionally normalbloodcells CTMcouldbeanindicationofhighermetastaticpotential Metastaticlungcancer Colorectacancer Livercancer Renalcancer Breastcancer Prostatecancer microsievechip Flowcytometry size basedfiltration ISET microvortexherringbone chip Cellsearch high definitionfluorescencescanningmicroscopy CTM的检测 CTC的研发趋势 Advantage CtDNAasanalternativetoCTCanalysis CTC与CTDNA的分析比较 CTC的研发趋势 端粒酶的活性与CTC的检测 Telomerasehasbeenfoundactivatedinthemajorityofcancertypesandisknowntobeassociatedwithmalignantproperties AssessingtelomeraseactivitymayasamethodtoaccuratelydetectentireCTCpopulations bloodsamplehastobeCellswerelysedinordertomeasuretheenzymeactivity therebydestroyingallintactCTCs advantage disadvantage CTC的研发趋势 AptamertechnologyinCTCDetection Aptamers single strandedRNAorDNAmolecules molecularweightisabout8to15kDa leadingtorapidtumorpenetrationandbloodclearance Incorporationofaptamertechnologyintomicrodeviceshasthemostpotentialforthedevelopmentofafast easy andaccuratemethodforcellisolation enrichmentandrelatedpurposessuchasdetection enumeration andcharacterization Aptamerproduction SELEXtechnique lessexpensiveandmuchfaster duetosmallsize simplestructure andnouseofanimalcells CTC的功能研究 Thanks