实验一土壤中淀粉酶产生菌的分离和纯化.doc

实验一 土壤中淀粉酶产生菌的分离和纯化一、目的和要求1.掌握常用培养基的配制方法。2.掌握微生物的分离、纯化及菌种保藏的基本原理和方法。3.练习微生物接种、移植和培养等基本技术，掌握无菌操作技术。二、基本原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中，混杂生存着大量不同种类的微生物，从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等方法分离、纯化出该微生物，直至得到纯菌株。需要注意的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不能保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养需要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。土壤是微生物生活的大本营，这里生活的微生物在数量和种类上都是极其多样的，因此，土壤中的微生物具有较高的丰富度和多样性，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。本实验将采用平板分离法从土壤中分离出淀粉酶高产的菌。三、试验材料1.样品：草坪采集的新鲜土壤2.培养基2.1 平板筛选培养基 牛肉膏5g 蛋白胨10g NaCl 5g 可溶性淀粉 2g蒸馏水 1000ml，调节PH为7.0，121灭菌20min（固体培养基，则每升培养基中加20g琼脂）。2.2 斜面培养基 牛肉膏5g 蛋白胨10g NaCl 5g 可溶性淀粉 2g蒸馏水 1000ml，调节PH为7.0，121灭菌20min（固体培养基，则每升培养基中加20g琼脂）。 3.溶液和试剂新鲜土壤、蒸馏水、蛋白胨、牛肉膏、琼脂、可溶性淀粉、稀碘液、NaCl、1M/L NaOH溶液、1M/LHCl溶液4.仪器或其它用具无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、微量移液器、移液器枪头、恒温培养箱、无菌工作台、天平、吸耳球、pH计、量筒、试管、三角瓶、玻璃珠、漏斗、分装架、玻璃棒、烧杯、铁丝筐、接种环、酒精灯、牛皮纸、纱布、铁架台、电炉、灭菌锅、干燥箱、水浴锅、冰箱等四、试验路线称取土样梯度稀释平板筛选斜面接种平板划线分离纯化五、操作步骤1培养基的制备1.1 称量 按培养基配方依次准确称取各药品，放入适当大小的烧杯中，蛋白胨极易吸潮，称量应迅速；牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可放称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。1.2 溶化 在烧杯中先加入4/5总体积蒸馏水。将药品完成溶解后，倒入锅中加热至煮沸时加入琼脂，边夹边搅拌直到琼脂完全溶解。1.3调Ph 根据培养基对pH的要求，用1M/L NaOH或1M/LHC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等,最后补充水到所需总体积。1.4 分装 过滤后立即用漏斗进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜，固体分装量为管高的1/5，灭菌后制斜面；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。1.5 加塞 培养基分装完毕，在试管口或三角烧瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。1.6 灭菌 将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜，放回内层锅，并装入培养基，加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，加热，0.103MPa，121并同时打开排气，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气完全排尽后，关上排气，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升；当锅内压力升到所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间。30min后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至”0”时，打开排气，旋送螺铨，打开盖子，取出。1.7 搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至50左右，将试管口端搁置在玻棒或其它合适高度的器具上，斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。1.8 倒平板 将灭菌后的培养基，于水浴锅中冷却到5560，立刻倒平板，倒平板的方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板。2 淀粉酶产生菌的富集培养2.1采土样 选择较肥沃的土壤，铲去土表层，挖520cm深度的土壤数10g，装入灭菌的牛皮纸袋内，封好袋口，做好编号记录，携回实验室备用。2.2 制备土壤稀释液 称取土样l0g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇20min，使土样与水充分混合，将菌分散，即为稀释10-1的土壤悬液。取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管，在土壤稀释过程中，应用一支吸管由浓到稀，稀释到底。2.3 涂布平板 取9个筛选培养基，用记号笔在培养皿底部贴上标签，分别注明稀释度（10-2、10-3、10-4、10-5、10-6）、组别和班级，然后用无菌吸管分别由10-2、10-3、10-4、10-5、10-65管土壤稀释液中各吸取0.1ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置，右手拿无菌玻璃涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5l0min，使菌液浸入培养基。2.4 培养 将培养基平板倒置于37培养箱中培养2-3日。3.高产淀粉酶菌种的分离纯化3.1斜面接种 从平板上挑取7个生长良好的单菌落接种到斜面上。将接种环垂直放在火焰上灼烧，镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，需要彻底灼烧。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。将灼烧灭菌的接种环插入平板内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从平板上刮取少许菌取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。在斜面的正上方距离试管口2-3cm处贴上标签，在标签纸上写明接种的菌对应的平板，同时在平板上标记取菌的位置并一一对应标号。3.2淀粉水解圈筛选每个平板上滴加适量碘液，观察测量水解圈直径与菌落直径的比值H/C（菌产生淀粉酶分解其周围培养基的淀粉滴加碘液后不变蓝色形成透明圈）。对照7支保菌斜面，选取其中产生水解圈且D/H较大的3支进行四区划线分离纯化产酶菌株33划线操作3.3.1 挑取含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取斜面保藏的少量菌种。3.3.2 划A区：将平板倒置于酒精灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着酒精灯(这时皿盖朝上，仍留在酒精灯旁)，右手拿接种环先在A区划34条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。3.3.3 划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区(菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。3.3.4恒温培养：将划线平板倒置，于37（或28）培养，24hr后观察。六注意事项1 整个操作在无菌条件下进行2 配置固体培养基时要等溶液煮沸再加琼脂3 稀释土壤悬液时每次换枪头4 高压蒸汽灭菌过程中，注意不要将待灭菌的物品摆放太密，以免妨碍空气流通；灭菌结束后，应待压力降至接近“0”时，才能打开放气阀，过早过急地排气，会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外