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Expressionofintein taggedfusionproteinanditsapplicationsindownstreamprocessing 内含肽标签融合蛋白的表达及其在下游工序中的应用 Seminar2009 12 17 2 宁夏大学生科院宋振威 introduction 3 宁夏大学生科院宋振威 introduction 4 宁夏大学生科院宋振威 引言 重组蛋白的纯化目标 减少成本 传统步骤缺点 1 步骤多 2 需要蛋白酶 内含肽改变了遗传信息的传递 步骤 不需要蛋白水解酶参与 新技术门类 内含肽技术 5 宁夏大学生科院宋振威 两类纯化方案图例 6 宁夏大学生科院宋振威 Originoftheterm intein anditsstructuralandfunctionalcharactestics 7 宁夏大学生科院宋振威 Originoftheterm intein anditsstructuralandfunctionalcharactestics 8 宁夏大学生科院宋振威 内含肽的起源 结构 功能 1990年 蛋白自切割生物学事件 嵌入的蛋白质 独立催化蛋白质前提成熟 类似于内含子 但是被转录和翻译 转录后水平的机制 相当于复合酶体 包含两个功能域 双功能 核酸内切酶 自我催化切割 350 550氨基酸 长至1650个氨基酸 广泛存在于细菌 古细菌 真核生物 DNA代谢功能或途径 合成酶 重组酶 核糖核酸还原酶 序列相似性低 但结构 机制 进化等高度相似 9 宁夏大学生科院宋振威 内含肽的起源 结构 功能 大部分内含肽为可移动的遗传元件 分开同源的等位基因 被认为也是寄生遗传元件 病原性分支分支杆菌 序列多变 基因重排导致 反式剪切的应用 构建环状分子 10 宁夏大学生科院宋振威 Mechanismofintein basedproteinsplicing 11 宁夏大学生科院宋振威 Mechanismofintein basedproteinsplicing 12 宁夏大学生科院宋振威 内含肽的机制 亲核置换反应 四步 1 N S或N O转换 2 转酯 3 Asn环化 4 S N重排 酯键形成肽键 实质是N端的断裂 C介导的断裂和连接 特点 1 只在体内完成 2 Cys Ser His Asn 3 多种残基参与 13 宁夏大学生科院宋振威 C 端残基 用Asp代替Gln 正调 用Ala代替His 负调 另类的内含肽 N端为电荷中转系统 内含肽的机制 14 宁夏大学生科院宋振威 Characteristicsandadvantagesofintein taggedexpressionsystem 15 宁夏大学生科院宋振威 Characteristicsandadvantagesofintein taggedexpressionsystem 16 宁夏大学生科院宋振威 Characteristicsandadvantagesofintein taggedexpressionsystem 17 宁夏大学生科院宋振威 内含肽标签表达系统的特点 1997年 NEB商品化系统 传统亲和标签去除需要酶的催化 1 酶不一定总是特异的 2 温度可能影响到蛋白的结构和活性 3 需要去除酶和标签的步骤 内含肽介导的纯化系统 1 不需要酶 简化步骤 节约成本 2 裂解反应可以原地发生在柱上 一步实现 3 温度 Ph诱导发生反应可以进一步简化 节约 18 宁夏大学生科院宋振威 IMPACT1 N C端均可融合目的蛋白 方便蛋白的优化表达和折叠 2 PH 温度诱导 防止硫醇类试剂对N端裂解的影响 3 可以不用在目的蛋白前加Met 4 如果目的蛋白N端存在Cys N端的融合策略是必要的 内含肽标签表达系统的特点 19 宁夏大学生科院宋振威 1 C端的序列较为主导 Met Tyl Phe较好 Asp Pro Gly Ala降低切割效率 2 N端Cys Arg Gly Arg Ser Arg较好 Pro不佳 3 C端的优于N端融合 综合考虑 优化构象 裂解条件 内含肽标签表达系统的特点 20 宁夏大学生科院宋振威 Applicationofintein taggedaffinitysysytemtotargetproteinpurification 21 宁夏大学生科院宋振威 Applicationofintein taggedaffinitysysytemtotargetproteinpurification 22 宁夏大学生科院宋振威 Applicationofintein taggedaffinitysysytemtotargetproteinpurification 23 宁夏大学生科院宋振威 酿酒酵母胞液ATPase亚单位A 端Asn454代替了Ala 基本步骤 上柱 诱导 洗脱 透析 检测 得率 活性 产量 IMPACT TM N端融合MBP十个残基 hGMCSF maxadilanandM65 同步复性蛋白 目的蛋白纯化的内含肽亲和标签系统的应用 24 宁夏大学生科院宋振威 目的蛋白纯化的内含肽亲和标签系统的应用 25 宁夏大学生科院宋振威 目的蛋白纯化的内含肽亲和标签系统的应用 26 宁夏大学生科院宋振威 SSPDnaBintein 1 C端融合 2 依赖于PH 温度 3 可以允许目的蛋白N的Cys 4 边表达边裂解 以研究合成的类似物的研究 5 hEGF中有很多的Cys 形成二硫键 两种策略 目的蛋白纯化的内含肽亲和标签系统的应用 27 宁夏大学生科院宋振威 1 不用进行目的蛋白N C端的突变 2 可以使用His标签和纤维素标签 3 ELP作为融合对象 改变PH即可 目的蛋白纯化的内含肽亲和标签系统的应用 28 宁夏大学生科院宋振威 1 适合二硫键的形成 2 重折叠效率高 3 几丁质亲和柱 4 简化步骤 目的蛋白纯化的内含肽亲和标签系统的应用 29 宁夏大学生科院宋振威 1 可以利用的物质 CBD ELP CBD 多聚His MBP 2 PHB系统 现状 1 实验室阶段 2 适用于高密度 发酵工艺 3 潜力大 目的蛋白纯化的内含肽亲和标签系统的应用 30 宁夏大学生科院宋振威 Conclusionandoutlook 31 宁夏大学生科院宋振威 Thankyou