SEREX技术肿瘤相关抗原的筛选方法ppt课件

1,SEREX技术 -肿瘤相关抗原的筛选方法,2,目录,SEREX的概况 SEREX的原理 SEREX的基本流程 SEREX发现的抗原 SEREX的优点与缺点 SEREX的改进 展望,3,SEREX概况,中文名称：重组表达cDNA克隆的血清学分析技术 英文名称：serological analysis of recombinantly expressed cDNA clone(SEREX) 定义：用肿瘤患者血清从肿瘤细胞cDNA表达文库中筛选和寻找肿瘤抗原基因的方法。 SEREX，是1995年由德国血清学家Sahin等建立的从分子水平鉴定肿瘤抗原的方法，开创了血清学检测肿瘤抗原的新时代。,4,SEREX技术原理,提取肿瘤细胞或组织的mRNA，构建cDNA表达文库，用含高滴度抗体的患者血清筛选cDNA文库，经过2-3轮复筛后获得阳性单克隆。对所获得的阳性克隆经过体内删除成为噬菌粒后进行序列测定，然后对其进行生物信息学分析，再进一步展开对这些基因的结构和功能的研究。,5,SEREX技术基本路线,6,SEREX技术具体方法,cDNA表达文库的构建 从新鲜肿瘤标本或肿瘤细胞株抽提总RNA，逆转录合成cDNA后重组到噬菌体ZAP表达载体中，经体外包装后转染大肠杆菌，收集噬菌体即为cDNA表达文库。 cDNA文库的免疫筛选 从构建的cDNA文库抽取少量噬菌体，转染大肠杆菌，铺入LB培养皿，孵育过夜，次日将噬菌斑转印至硝酸纤维素膜（NC膜），接着5%脱脂奶粉（NFDM）于室温封闭NC膜1h，后用TBS液冲洗干净，用1：200经预处理的自体血清与NC膜室温孵育5-6h，再用TBS冲洗，将膜同1：3000稀释的碱性磷酸酶（AKP）标记羊抗人IgG抗体孵育1h，最后进行显色反应。挑取阳性克隆，阳性克隆再次扩增进行第2轮、第3轮筛选纯化。,7,SEREX技术具体方法,对阳性克隆进行DNA序列分析 在Genbank中用BLAST进行对比分析，判定该基因序列是已知还是未知，还可根据人类基因组图谱对阳性cDNA序列进行染色体基因定位。 采用Southern blot或RT-PCR检测阳性克隆cDNA在正常组织组织及肿瘤中的表达情况。 采用Northern blot检测肿瘤抗原mRNA的表达，确定肿瘤抗原的组织表达谱。 采用Western blot分析各种组织中肿瘤抗原的表达。 用已知抗原检测体内相应抗体的浓度，定量分析肿瘤特异性抗体及其临床意义。,8,SEREX鉴定肿瘤抗原的分类,通过SEREX方法已经在黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、小细胞肺癌、等恶性肿瘤中找到了约1500种抗原，用该方法鉴定出来的抗原按来源和性质可分为以下几类： CT抗原 分化抗原 突变抗原 过表达抗原 剪切变异体抗原,9,应用SEREX发现的抗原,肝癌：罗国荣等筛选出肝癌相关抗原SMP-30和Kinectin，并应用基因工程技术方法构建、表达、和纯化出肝癌相关抗原SMP-30和Kinectin的融合蛋白，采用western blot和ELISA检测出SMP-30和Kinectin相应抗体在肝癌患者血清中有较高的阳性率。 卵巢癌：王颖等发现MY-OVA-13基因；周芙玲发现12个新基因 鼻咽癌：谢可发现一个新的热休克蛋白基因家族的抗原；黄绍明发现了14个新的鼻咽癌相关抗原；舒峻筛选出16个抗原，并首次在鼻咽癌组织中筛选出金属硫2A基因,10,应用SEREX发现的抗原,结肠癌：Scanlan等在结肠癌中发现17个新基因 大肠癌：何敬东等筛选获得16个阳性克隆, 代表12个不同抗原基因 肺癌：Gure等发现8个抗原，以NY-LU-12抗原最重要 胰腺癌：Nakatsura等发现5个新基因高表达 白血病：Itoh等在成人T淋巴白血病中发现3个抗原 胃癌：王运伟等筛选出14个胃癌肿瘤相关抗原编码基因,11,SEREX技术的优点,通过构建文库进行筛选 简化筛选步骤 筛选的抗原分子多为全长cDNA，可诱导细胞免疫和体液免疫，且不易导致肿瘤抗原编译丢失 cDNA文库可以来源于肿瘤组织，也可以来源于细胞系，筛选血清可以是自体血清，也可以是同源异体血清 cDNA表达克隆的血清学分析，不只限于分析肿瘤细胞的表面抗原，它涵盖了由肿瘤基因编码的大多数蛋白 将病人血清稀释后进行筛选，使得免疫分析仅限于那些可以诱导强免疫反应的抗原 使用病人多克隆抗体血清筛选，使得在一次筛选过程中，可以鉴定出多个抗原,12,SEREX技术的缺点,SEREX技术必须构建cDNA基因表达文库，并且仅局限于对一个或者很少几个病人血清的筛选，代表性差 SEREX技术不能检测肿瘤表达的所有抗原。 因为在SEREX方法中，抗原在细菌-噬菌体系统中表达后，不能正确折叠和翻译后修饰，所以不适用于鉴定具有翻译后修饰功能的肿瘤相关抗原 对某些在肿瘤发展的不同阶段表达的抗原，若取新鲜组织标本的时间与该抗原表达的阶段不一致也将被漏检,13,SEREX的改进,去除假阳性：筛选血清可以通过与野生型的细菌-噬菌体裂解物预吸收来消除同细菌或噬菌体复合物起反应的人血清抗体。 将制成的肿瘤cDNA文库与正常组织cDNA文库进行消减杂交，消减后的肿瘤cDNA再进行血清学筛选，可排除在正常组织中有明显表达的基因。 发展真核表达系统：蛋白质的构造和翻译后修饰对抗原作用的发挥及其重要，也影响其免疫原性。 将蛋白质组学与SEREX方法结合起来,14,SEREX展望,SEREX&MDV=？ 重组cDNA表达文库血清学分析技术在腰椎间盘突出症自身抗原筛选中的应用前景；2010 应用SEREX技术筛选和鉴定肺癌相关抗原的研究进展广西医科大学研究生院；2009 应用SEREX技术筛选和鉴定非小细胞肺癌肿瘤相关抗原北京市结核病胸部肿瘤研究所；2009SEREX方法在肿瘤相关抗原筛选中的应用河南中医学院基础医学院；2009,15,卵巢上皮性癌相关抗原筛选中SEREX 技术的应用广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科；2008 SEREX技术在筛选疾病相关抗原中的应用河北大学生命科学学院生物芯片研究室；2008 SEREX技术的研究进展广西医科大学组织学与胚胎学教研室；2008 SEREX在肿瘤抗原分析中的研究进展中南大学湘雅医学院肿瘤研究所，2002,16,请批评指正！,