食品中空肠弯曲菌检测ppt课件

粪便中空肠弯曲菌检测 1 一 空肠弯曲菌的分类和特性 属于弯曲菌属 主要包括空肠弯曲菌 Campylobacterjejuni 结肠 或大肠 弯曲菌 Campylobactercoli 海鸥弯曲菌 Campylobacterlari 乌普色拉弯曲菌 Campylobacterupsalensis 胎儿弯曲菌 Campylobacterfetus 等11种 其中空肠弯曲菌 C jejuni 对食品安全的威胁最为严重 2 空肠弯曲菌 Campylobacterjejuni 是从20世纪80年代起受到国内外广泛重视的人畜共患病菌 致病性 人类 急性细菌性肠炎 格林 巴利综合征 GBS 食物中毒 动物 雏鸡腹泻与肝炎 火鸡的肝炎与蓝冠病 犊牛的腹泻 绵羊的腹泻或流产 3 空肠弯曲菌的生物学特性 革兰氏染色阴性 呈弧形 S形或螺旋形 菌体两端尖 有极鞭毛 能做快速直线或螺旋体状运动 1 5 5 m 0 2 0 5 m 无荚膜 微需氧环境 5 O2 10 CO2和85 N2 最适生长温度 42 43 37 可生长 30 以下不生长 4 空肠弯曲杆菌的流行病学和临床表现 宿主 家禽 野生鸟类为最主要的传染源 Rosef等在1981年调查了129个野生鸟类 结果表明24 8 携带空肠弯曲菌 鸟类迁移会造成病原菌对湖水与河水的污染 5 细菌分布范围 该菌分布广泛 已从多种动物中分离出 也发现于食物与饮水中 尤其是畜禽肉及脏器与鲜奶 食用动物中鸡的带菌率为首位 其次为猪 主要分布在活鸡的消化系统中如腺胃 十二指肠 空肠 回肠 盲肠 直肠 泄殖腔等 该菌在人或动物的粪便中存活约4周 在被污染的水源中可存活约5周 6 感染途径 传播途径主要是由于摄取了该菌污染的食物与饮水后 细菌在人肠道内大量生长繁殖 引起急性肠炎 被污染的禽肉与未经过巴氏消毒的牛奶是导致发病的主要原因 7 患者临床表现 患者表现为发热 腹泻 呕吐或肌肉痛 潜伏期平均3 5天 病程约7 10天 粪便的特征是有时带血 镜检中有多形核白血球 重症病例也有痢疾样血 粘液粪便 8 根据美国疾病控制与预防中心 USA CDC 多年的美国食源性病原微生物引起发病人数的统计资料 空肠弯曲菌导致的病例数排名第二 禽肉 生牛奶中的空肠弯曲菌被美国列为重点监测食源性致病菌之一 32ndCCFH 1999年 提出5组优先评估的 病原 食品 组合 其中包括 禽肉 空肠弯曲菌 空肠弯曲菌在许多发达国家也是被报告最普遍的胃肠炎致病菌之一 如 美国 英国 丹麦 芬兰 爱尔兰 荷兰 挪威 瑞典 瑞士等 9 NCTC11168基因组图谱 基因组相对小 大小在1 6 1 7Mbp DNA中富含A T G C比率在29 47mol 由于基因组体积小 对培养要求就比较苛刻 NCTC11168共有碱基对1 641 481个 含有1654个基因组 A T的含量在69 10 二 粪便中空肠弯曲菌的检验技术 11 空肠弯曲菌 空肠弯曲菌 在微需氧条件下42 生长而25 不能生长 在选择性固体培养基上形成特征性菌落 按照本标准检验时具有相符合的运动特性 生长特性与生化特性的革兰氏阴性菌 12 设备和材料 微需氧培养装置 能够提供微需氧条件 5 O2 10 CO2和85 N2 如使用产气剂的厌氧罐 袋或其它可代用的装置等 13 三气培养箱 如Binder等 14 弯曲菌检验程序 15 增菌液接种 方法一 稀释处理将24h和48h的增菌液原液分别划线接种mCCDA平板 备注 也可选用CFA显色平板或SimPlate分离鉴定及定量培养基 优点 经济 方便缺点 可能会有杂菌干扰 16 mCCDA平板上所挑取的可疑菌落通常带有金属光泽 扁平 湿润 沿划线生长 17 CFA显色平板上所挑取的可疑菌落为红色 突起 湿润 菌落较小直径约2 3mm 边缘有一圈红色的透明环 中间有一个圆形的不透明 颜色较深的红色小点的菌落 18 将所挑取的3 5个可疑菌接种到不含抗生素的哥伦比亚血琼脂平板 微需氧条件下42 0 5 培养24h 48h后 进行后续的空肠弯曲菌鉴定 19 快速鉴定1 形态与动力性检测 对挑取菌落进行革兰氏染色镜检 空肠弯曲菌为革兰氏阴性 弯曲如小逗点状 两菌体的末端相接时 呈S形 海鸥展翅状或螺旋状 对挑取可疑菌落制作湿片 镜检可见本菌呈螺旋样运动 20 快速鉴定 2 氧化酶试验使用铂 铱接种环或玻璃棒 挑取单个菌落的一部分 然后接种到用氧化酶试剂润湿的滤纸上 如果在10秒内出现紫红色 紫罗兰或深蓝色为阳性 弯曲菌则为阳性 21 快速鉴定 3 过氧化氢酶检测挑取一环菌落培养物 加到在干净显微镜玻片上的一滴3 过氧化氢溶液中 如果在30秒内出现气泡则判定结果为阳性 22 快速鉴定 4 马尿酸盐水解试验挑取欲检测的菌落培养物 加到盛有0 4mL1 的马尿酸钠的试管中制成菌悬液 注意不要带入培养基琼脂 混合均匀后在37 水浴中温育2h或36 培养箱中温育4h 轻轻地在马尿酸盐溶液的顶部加入0 2mL茚三酮溶液 不要振荡 在37 水浴或36 培养箱中温育10min后判读结果 若出现黑紫色则为阳性 若出现淡紫色或没有颜色变化则为阴性 23 快速鉴定 5 吲哚乙酸脂水解试验挑取欲检测的菌落培养物 加到羟基吲哚醋酸盐纸片上面 再滴加一滴灭菌蒸馏水 如果吲哚乙酸脂水解 则在5 10min内出现深蓝色 若没有颜色变化则表示水解反应没有发生 24 后续鉴定1 微需氧条件下25 生长试验2 有氧条件下42 0 5 生长试验3 先锋霉素 头孢霉素 的敏感性检测 可选 ISO 奈啶酮酸的敏感性检测 越来越多的C jejuni与C coli的非特异性菌株出现 25 后续鉴定 微需氧条件下25 生长试验挑取欲检测的菌落培养物 接种到哥伦比亚血琼脂平板上 25 微需氧条件下培养48 4h 若为空肠弯曲菌则不出现生长 26 后续鉴定 有氧条件下42 0 5 生长试验挑取欲检测的菌落培养物 接种到哥伦比亚血琼脂平板上 42 0 5 有氧条件下培养48 4h 若为空肠弯曲菌则不出现生长 27 后续鉴定 先锋霉素 头孢霉素 的敏感性检测 可选 挑取菌落培养物 在布氏肉汤中制备成浓度为0 5McFarland的菌悬液 再用布氏肉汤制备1 10的稀释液 在5 MuellerHinton血琼脂平板上进行涂布 静置5min后去除多余液体 将平板在36 培养箱中放置10min 将先锋霉素 头孢霉素 药敏纸片放在琼脂表面 培养皿盖子在上面 36 微需氧条件下将平板培养22 2h 如果细菌紧贴着纸片生长则为有抗性 如果纸片周围出现不同程度的细菌抑制生长则为敏感 28 主要弯曲菌的生化特性与鉴定表 空肠弯曲菌结肠弯曲菌海鸥弯曲菌乌普萨拉弯曲菌 形态 动力性 革兰氏阴性 弯曲如小逗点状 两菌体的末端相接时呈S形或螺旋状或海鸥展翅状 并呈现螺旋样运动氧化酶试验 阳性过氧化氢酶试验 或微弱马尿酸盐水解试验 吲哚乙酸脂水解试验 先锋霉素敏感性 RRRS微需氧条件25 生长试验 不生长有氧条件42生长试验 不生长 注 阳性 阴性 S敏感 R有抗性 29 已试用过的弯曲菌生化鉴定与筛选检测的商品化试剂 C 1弯曲菌的生化鉴定系统C 1 1API为手工生化鉴定系统 用于弯曲菌的菌种鉴定 鉴定结果准确 所需时间1天 需要一定的技术与经验积累 C 1 2VITEK2为自动生化鉴定系统 可以鉴定出空肠弯曲菌空肠亚种 结肠弯曲菌 胎儿弯曲菌胎儿亚种 且结果准确 操作简便 所需时间6小时左右 30 微生物API鉴定系统 31 C 2弯曲菌的筛选检测方法C 2 1miniVidas用于弯曲菌的初筛 原理为酶联荧光免疫分析 ELFA 方法 对于结果阴性的可以直接判定为阴性 对于结果阳性的需进一步确认 可比传统方法快2天 具体参照厂家说明 C 2 2BAX系统原理为利用PCR进行基因检测 用于空肠弯曲菌和大肠弯曲菌的筛选 阳性结果仍需确认 32 空肠弯曲菌检测流程 样本制备 增菌 检测 样本 选择性增菌肉汤 微需氧培养 阴性结果无空肠弯曲菌 初筛方法检测 选择性平板进行分纯培养 阳性结果 经典培养鉴定方法 微生物手工 自动生化鉴定系统 基因鉴定方法 33 谢谢大家 34