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小吞噬实验,1,掌握血液中的中性粒细胞体外吞噬异物能力的测定方法。 观察机体的非特异性免疫现象。,实验目的,2,人外周血中性粒细胞吞噬功能检测（体外实验）。 小鼠腹腔中性粒细胞吞噬功能的检测（体内实验）。,实验内容,3,一.人外周血中性粒细胞吞噬功能检测（体外实验）,实验原理,血液中的中性粒细胞即小吞噬细胞，通过趋化、调理、吞入和杀菌等步骤，能吞噬和消化衰老，死亡细胞即病原微生物等异物，是机体固有免疫的重要组成部分。将白细胞悬液与细菌混合，保持一定时间后，取样涂片染色镜检，可以测定中性粒细胞吞噬细菌的百分率和吞噬指数。本实验有助于诊断疑有吞噬细胞障碍的疾病。在某些情况下，小吞噬细胞也参与某些超敏反应和自身免疫疾病的组织损伤和炎症过程，因此，测定小吞噬细胞的功能可在一定程度上反映机体的免疫状态，也可作为判定疗效的一种指标。,4,来 源： 骨髓。 存在部位： 血液 、 炎症部位（全身）。 功能基础：溶酶体，过氧化物酶及杀菌物质。 功 能：具有吞噬细菌和清除溃残物质等防御功能。 反应时间及寿命：反应时间快,数分钟到几小时，寿命短.平均数小时。,小吞噬细胞,5,菌液：表皮葡萄球菌菌液（9亿/ml） 抗凝剂：3.8%枸橼酸钠或肝素（25U/ml） 毛细吸管、凹玻片、载玻片、 牙签、甲醇、瑞特-吉姆萨染液、pH6.4PB、酒精棉球、采血针等。,实验材料,6,1、取样,2、孵育,3、制片,4、镜检,3.8%枸橼酸钠或肝素 0.4ml,无菌采血 0.2ml,菌液 0.02-0.04ml,单凹玻片,湿盒,孵箱,370C孵育30-45min,实验步骤,7,取一小滴上述混合液，置于载玻片上，用另一载玻片推成薄血片，自然干燥。 滴加甲醇固定5min，水洗。 置瑞特液1min，置pH6.4PB中3min，置吉姆萨液染5-10min。水洗，待干。,制片,8,红细胞,中性粒细胞,葡萄球菌,镜检,9,油镜观察下，中性粒细胞细胞质呈淡蓝色，细菌呈深蓝色，红细胞呈褐色，细胞核呈紫色。,结果观察,10,计数100个中性粒细胞，同时计数吞噬细菌的中性粒细胞数以及被吞噬的细菌总数，计算吞噬百分率或吞噬指数。吞噬百分率=吞噬指数=,表示法,吞噬细菌的中性粒细胞数,100,X 100%,100个吞噬细胞吞噬的细菌总数,100,11,人类白细胞的吞噬活性在37时最好，温度过高过低均会使其吞噬能力减低。 个体差异、年龄、健康状况的不同，其吞噬能力亦不同。 掌握好细菌与中性粒细胞的作用时间。中性粒细胞对细菌的吞噬是一个非常迅速的过程，吞噬5min时吞噬率达45%，10min时接近80%，20min 即达饱和。 取“细菌全血”涂片时，要混匀后再取；制作血涂片要求推出尾部，过厚或过薄，均不利观察。,注意事项,12,二.小鼠腹腔中性粒细胞吞噬功能检测（体外检测）,15-20g小白鼠。 表皮葡萄球菌菌液（9亿/ml）。 瑞特-吉姆萨染液。 注射器及针头、无菌肉汤、解剖板、剪刀、镊子、碘酊、乙醇。,材料,13,诱导：实验前一天给小白鼠腹腔注射无菌肉汤0.5-1.0ml，轻揉腹部。 实验前4-5h给小白鼠腹腔注射无菌肉汤0.5-1.0ml，轻揉腹部。注射：实验时给小白鼠腹腔内注射表皮葡菌菌液0.5ml，轻揉腹部。取样： 注射后35 -45min处死小白鼠，用毛细吸管抽取腹腔液滴片或直接涂片 染色：标本干燥后瑞氏染-吉姆萨染液染色。（染色同体外法） 镜检，观察中性粒细胞吞噬表皮葡萄球菌的现象。,实验步骤,14,结果观察：油镜检查，先寻找白细胞，观察细胞质中有无被吞噬的细菌。结果表示法同体外实验。,结果观察及表示法,15,注射菌液时不要注射到皮下或腹腔脏器内，注射后轻揉腹部，使液体在腹腔内分散均匀 注意掌握好染色时间,注意事项,16,
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