中药化学成分的结构研究.ppt

中药有效成分化学结构的研究方法,化合物纯度的判定方法1结晶均匀、一致。2固态：熔点明确、敏锐（0.51.0）液态：沸程在5以内3TLC(PC):两种以上不同展开剂展开，均呈现单一斑点。4HPLC、GC也可以用于化合物纯度的判断。,一、中药有效成分的理化鉴定物理常数的测定物理常数的测定包括熔点、沸点、比旋度、折光率和比重等的测定。固体纯物质的熔点，其熔距应在0.51.0的范围内，如熔距过大，则可能存在杂质，应进一步精制或另用不同的溶剂进行重结晶，直至熔点恒定为止。液体物质可测定其沸点。液体纯物质应有恒定的沸点，除高沸点物质外，其沸程不应超过5的范围。此外，液体纯物质还应有恒定的折光率及比重。比旋度也是物质的一种物理常数。中药的有效成分多为光学活性物质，故无论是已知还是未知物，在鉴定化学结构时皆应测其比旋度。分子式的确定常用质谱法，高分辨质谱（HR-MS）3.化合物的结构骨架与官能团的确定一般首先决定化合物的不饱和度，准确计算出结构中可能含有的双键数或环数。用化学法推定分子结构骨架,二、四大光谱在结构测定中的应用,紫外可见光谱（UV-VIS）,紫外可见光谱（UV-VIS）共轭体系特征分子中电子跃迁（从基态至激发态）。其中，n-*、-*跃迁可因吸收紫外光及可见光所引起，吸收光谱将出现在光的紫外区和可见区（200700nm）。,200nm400700nm,紫外区（UV）可见区（VIS）,应用：推断化合物的骨架类型共轭系统取代基团的推断如：加入诊断试剂推断黄酮的取代模式（类型、数目、排列方式）用于含量测定（以最大吸收波长作为检测波长进行含量测定）,红外光谱（IR）,分子中价键的伸缩及弯曲振动所引起的吸收而测得的吸收图谱，称为红外光谱。,40003600300016001000625cm-1,特征频率区指纹区,特征官能团的鉴别化合物真伪的鉴别,羟基（酚羟基、醇羟基）36003200cm-1游离羟基3600cm-1氢键缔合羟基34003200cm-1羰基16001800cm-1酮1710cm-1酯17101735cm-1芳环1600、1580、1500cm-1有23个峰双键16201680cm-1,两个化合物完全相同的条件1、特征区完全吻合2、指纹区也需完全一致,红外光谱（IR）,红外光谱对结构的鉴定，主要用于功能团的确认和芳环取代类型的判断。,1H-NMR（核磁共振氢谱）,信息参数：化学位移（）、峰面积、峰裂分（s、d、t、q、m）及偶合常数（）,（1）化学位移（C）020ppm与1H核所处的化学环境（1H核周围的电子云密度）有关电子云密度大，处于高场，值小电子云密度小，处于低场，值大,0.9-C-CH3,1.8-C=C-CH3,2.1-COCH3,3.0-NCH3,3.7-OCH3,11109876543210,-COOH,-CHO,Ar-H,-C=C-H,常见结构的化学位移大致范围,(ppm),推断化合物的结构（含1H核基团的结构）,（二）峰面积:磁等同质子的数目用积分曲线面积（高度）表示,磁不等同两个或两组1H核在一定距离内相互自旋偶合干扰，发生的分裂所表现出的不同裂分,符合n+1规律(n=干扰核数目),用偶合常数（J）表示,峰裂分的数目,峰裂分的距离,不同系统偶合常数(JHz)大小,s单峰d双峰t三重峰q四重峰m多重峰,1H-NMR核磁共振辅助技术,（1）重氢(D2O)交换推断活泼质子（羟基）的存在与否。（2）核增益效应（NOE）：指在核磁共振中选择性照射一种质子使其饱和，则与该质子在立体空间位置上接近的另一或数个质子信号强度增高的现象。（范例见P31）,13C-NMR（核磁共振碳谱）,信息参数：化学位移（C）碳谱的化学位移的定义及表达方式与氢谱一致，所用内标也一样，但是化学位移的幅度较宽，约200个化学位移单位，故信号之间很少重叠，识别起来比较容易。,不同13C核C大小与13C核所处的化学环境（周围电子云密度）有关,用于13C核类型的推断,(Cppm),150220(c=o),200150100500,c=cAr,5080(c-o),饱和碳原子（060）,主要结构13C核C的大致范围,化学位移：大致范围（C）0200ppm,质谱（MS）:1确定分子量（高分辨质谱可将分子量精确到小数点后三位）,计算分子式。2与标准图谱比较用于化合物的鉴别（相同条件下，其裂解是符合一定规律的）。3依据裂解特征及碎片离子，推定或复核未知化合物分子的部分结构。,电子轰击质谱（EI-MS）,但对于热敏成分及难于气化的成分（醇、糖苷、部分羧酸等）大分子物质（多糖、肽类）难以气化,测不到分子离子峰亦无法测得分子量,对热不稳定性的化合物乙酰化或三甲基硅烷化（TMS化）制成热稳定性好的挥发性衍生物进行测定,(2)化学电离质谱CI-MS(3)场致电离FI-MS(3)场解析质谱FD-MS(4)快原子轰击质谱FAB-MS(5)电喷雾电离质谱ESI-MS,电离新方法（样品不必加热气化而直接电离）,第1节苷类的结构研究,苷类结构研究的一般程序：1.物理常数的测定。Mp.等。2.分子式的测定质谱分析法（广泛采用）电子轰击质谱（EI-MS）：不易获得分子离子峰（极性大）化学电离质谱（CI-MS）场解吸质谱（FD-MS）：常用快原子轰击质谱（FAB-MS）：常用高分辨快原子轰击质谱（HR-FAB-MS）：能直接测出分子式,3.组成苷的苷元、糖的鉴定,（1）苷元的结构鉴定（见各章节）（2）糖的种类鉴定纸色谱（PC）：分配原理，BAW系统，与对照品共色谱鉴定薄层色谱（TLC）：硅胶（硼酸溶液或无机盐溶液制-增加上样量）气相色谱（GLC）：水解、制备TMS衍生物（具挥发性），用对照品tR鉴定NMR光谱：苷中各糖的不同质子的、J与标准糖数据进行比较鉴定苷中各糖的不同碳原子的与标准糖数据进行比较鉴定,（3）糖的数目的测定,光密度扫描法测定各糖斑点含量，计算各糖分子比，推算组成苷的糖的数目质谱法测定苷及苷元的分子离子峰（分子量），计算其差值，求出糖的数目1H-NMR谱:端基质子的信号（大-处于低场）数目或者全乙酰化或全甲基化物乙酰氧基、甲氧基信号（、J）的数目13C-NMR谱:端基碳原子信号（90112ppm）的数目或者苷分子总碳信号数目减去苷元的碳信号数目,推算糖的数目,4.苷元与糖、糖与糖之间连接位置的测定,（1）苷元与糖之间连接位置的测定13C-NMR谱法：利用苷化位移规律，将苷与苷元的碳谱相比较即可鉴别醇羟基苷化，苷元-碳向低场位移（+410ppm），-碳向高场位移（-0.9-4.6ppm）酚羟基苷化，苷元-碳向高场位移，-碳向低场位移,化学方法:将苷的全甲基化物进行甲醇解，鉴定（与对照品共色谱）未全甲醚化的单糖，游离羟基所在位置即糖与糖之间的连接位置。,（2）糖与糖之间连接位置的测定,13C-NMR谱法：利用苷化位移规律，将苷与相应单糖的碳谱数据相比较即可鉴别。糖与糖相连，内端糖连接糖的碳原子移向低场（47ppm）相邻碳原子移向高场（-1-4ppm）,5.苷中糖与糖之间连接顺序的确定,苷,缓和酸水解酶解乙酰解全甲基化甲醇解,部分苷键断裂的裂解产物,分析推断,波谱分析法,质谱（MS）法：主要利用质谱中归属于有关糖基的碎片离子峰或各种分子离子脱糖基的碎片离子峰，可对糖的连接顺序作出判断。EI-MS：(需作成全甲基化、乙酰化或三甲基硅醚化物)常见各单糖及双糖的全乙酰化物、TMS衍生物碎片离子峰见书。FD-MS或FAB-MS：常出现各种脱去不同程度糖基的碎片离子峰。,6.苷键构型的确定,（1）利用酶水解法(酶的专属性)（2）利用开勒（Klyne）经验公式进行计算MD=MD苷-MD苷元,与各糖的一对甲苷（-、-）的分子比旋度相比较，与-甲苷接近，则该苷键构型为-构型与-甲苷接近，则该苷键构型为-构型,1H-NMR利用端基质子偶合常数的大小判断苷键构型,依据,相邻碳原子上质子偶合常数的大小与二者之间的立体夹角有关,H-2为键的糖（葡萄糖、木糖、半乳糖）,H-2为e键的糖（鼠李糖、甘露糖）,-苷键-苷键-苷键-苷键J12=23.5HzJ12=69HzJ12=2HzJ122Hz(Jae、60O)（Jaa、180）（Jee、60）（Jae、60O）,J12不相等J12相等,意义,可以用于构型的判断不能用于构型的判断,（3）利用核磁共振（NMR）确定苷键构型,-D-葡萄糖苷-L-鼠李糖苷J12=Jae=23HzJ12=Jae=2Hz,-D-葡萄糖苷-L-鼠李糖苷J12=Jaa=69HzJ12=Jae=2Hz,如表3-4，利用端基碳原子的化学位移判断苷键构型，除D-甘露糖、L-鼠李糖外，绝大多数单糖甲苷，其-型与-型的化学位移相差4ppm。如表3-5利用端基碳原子与端基质子的偶合常数判断苷键构型-甲苷JC1-H1170Hz-甲苷JC1-H1160Hz10ppm,13C-NMR谱：,例题：确定苷键构型的方法为（）A利用Klyne经验公式计算B1H-NMR中，端基氢偶合常数J=68Hz为-构型，J=34Hz为-构型。C1H-NMR中，端基氢偶合常数J=68Hz为-构型，J=34Hz为-构型。D13C-NMR中，端基碳与氢偶合常数J=160Hz为-构型，J=170Hz为-构型。E13C-NMR中，端基碳与氢偶合常数J=160Hz为-构型，J=170Hz为-构型。,一、化学方法（辅助手段）二、波谱技术：包括UV、IR、NMR、MS等四大光谱技术。目前已成为醌类化合物结构研究主要技术手段。尤其在样品量比较少的情况下，波谱技术为首选方法。特别是核磁共振技术、质谱技术。,第2节醌类化合物的结构研究,一化学方法,1锌粉干馏：母核推断2氧化反应：取代基推断3衍生物制备：甲基化物、乙酰化物,羟基蒽醌（-OH、-OH、醇OH、羧基）羟基数目、位置*甲基化试剂的选择性反应*（乙酰化试剂）推断元素分析或波谱分析（NMR）甲基化产物确定甲氧基数目（乙酰化产物）（确定乙酰基数目）,1、紫外可见（UV）光谱：共轭特征2、红外光谱（IR）:官能团特征3、核磁共振（13C谱）:分子骨架（1H谱）:基团特征4、质谱（MS）：分子量（M+.）,二波谱分析,苯醌240nm强峰285nm中强峰400nm弱峰,（苯甲酰基）245nm251nm335nm,萘醌,(醌样结构)257nm,（1）醌类化合物的紫外光谱特征,苯甲酰基：252nm325nm,醌式结构：272nm405nm,蒽醌母核的紫外光谱：,羟基蒽醌：,第一峰与羟基数目的关系：,第五峰与结构的关系：,羰基苯环羟基（16751653cm-1）(16001480cm-1)(36003130cm-1),羟基蒽醌,羰基与羟基(-OH)缔合的影响,羟基蒽醌红外光谱（IR）特征：,（2）红外光谱（IR）,缔和羟基,缔和羰基,游离羟基游离羰基,吸收峰向低波数位移,游离羰基（高波数）游离羟基（-OH）（36003150cm-1）缔合羰基（低波数）缔合羟基（-OH）（3150cm-1以下）,羰基峰的数目、位置与-羟基的数目及位置有关,-羟基数目及位置对羰基频率的影响：,3.核磁共振氢谱(1H-NMR谱),(1)醌环上质子,醌环质子（2、3、5、6）672（）,芳环质子8.06(-H,5、8)7.73(-H,6、7),醌环质子6.95(),(2)芳环上质子,萘醌,苯醌,蒽醌芳环上质子：,-H（1、4、5、8）8.07-H（2、3、6、7）7.67,蒽醌,(3)取代基质子的化学位移及对芳环质子的影响,甲基质子2.12.9（或宽）（供电基，邻芳氢-0.15）,（大黄素）,-OH质子1112邻、对芳氢-0.45,-酚羟基质子（）160ppm)C-7(C-OH,s.160ppm)，受羰基吸电共轭的影响C-9(季碳，C-O-,s.149.0154.0ppm)C-10(季碳，s.110.0113.0ppm)C-4(C=C,d.143.0145.0ppm)，受羰基吸电共轭的影响C-3(C=C,d.110.0113.0ppm)C-2C-7C-9C-4C-5C-6C-3C-10C-8160以上110.0113.0110以下,13C-NMR谱特征：,（2）出现一系列失去CO的碎片离子峰，最主要碎片离子峰是M-CO+峰。,（3）具有甲氧基取代的香豆素经常出现失去甲基（-CH3）的碎片离子峰。,4质谱（MS）特征,（1）大多具有很强的分子离子峰M+，简单香豆素和呋喃香豆素的分子离子峰经常是基峰。,花椒毒内酯质谱裂解途径,一.紫外可见光谱在黄酮类化合物结构测定中的应用一般鉴定程序：1、先测定在甲醇中的光谱。2、再测定在加入各种诊断试剂后的紫外光谱。3、如为苷类，则可水解或甲基化后再水解，并测定苷元或其衍生物的紫外光谱。4、将以上各种光谱数据（或光谱图）进行对比分析，即可获得有关结构信息。,第4节黄酮类化合物的结构研究,黄酮（醇）：带II、带I均强母核光谱特征二氢黄酮类、异黄酮类：带II强、带I弱母核的推断（甲醇）查耳酮、橙酮：带II弱、带I强,取代基：OH等，为助色团依红移规律推断取代基团,甲醇钠：强碱，所有酚羟基解离醋酸钠：碱性弱，酸性强的酚羟基解离加入诊断试剂醋酸钠/硼酸：邻二酚羟基络和相应吸收峰红移,三氯化铝：3-OH，4-羰基5-OH，4-羰基络和邻二酚羟基,黄酮类化合物在甲醇中紫外光谱特征,苯甲酰系统桂皮酰系统（带II220280nm）（带I300400nm）黄酮类化合物结构中的交叉共轭体系,二氢黄酮（醇）异黄酮（二氢）（由B环产生的桂皮酰系统不存在，带I弱，带II强）,黄酮类化合物在甲醇中紫外光谱特征,黄酮类化合物母核UV吸收特征,母核类型带II（nm）带I（nm）备注黄酮250280（强）304350（强）典型的交叉共轭系统黄酮醇（3-OH游离）250280（强）358385（强）3-OH供电共轭，带1红移黄酮醇（3-OH取代）250280（强）328357（强）3-OH供电减弱，使黄酮,异黄酮245278（强）(sh)桂皮酰系统破坏二氢黄酮（醇）270295（强）(sh)查耳酮220270（弱）340390（强）橙酮230270（弱）370430（强）花青素（苷）270280465560（可见区）,（2）取代基团对共轭吸收的影响,黄酮类核中引入-OH（酚羟基）等供电基团，使共轭程度增强，相应的吸收峰红移。一般，A环引入OH，带II红移，B环引入OH带I红移。羟基甲基化或苷化后，原酚羟基的供电能力下降，引起相应的吸收峰紫移。3-OH甲基化或苷化，带I紫移，5-OH（与羰基形成分子内氢键）甲基化，带I、带II均紫移515nm，4-OH甲基化，带I紫移310nm。羟基乙酰化后，乙酰基的吸电作用，使原来酚羟基对共轭系统的供电能力消失，对光谱的影响亦将完全消失。,黄酮、黄酮醇加入诊断试剂后吸收峰（带I、带II）的位移规律诊断试剂位移规律归属,NaOMe带I红移4060nm，强度不降示有4-OH带I红移5060nm，强度下降示有3-OH、但无4-OH,NaOAc带II红移520nm示有7-OH,2.加入诊断试剂后引起的位移及其在结构测定中的意义,NaOAc/H3BO3带I红移1230nm示B环有邻二酚羟基带II红移510nm示A环有邻二酚羟基（不包括5，6-邻二酚羟基）,诊断试剂位移规律归属,AlCl3及AlCl3/HClAlCl3/HCl谱图=AlCl3谱图示无邻二酚羟基AlCl3/HCl谱图AlCl3谱图示可能有邻二酚羟基AlCl3/HCl谱较AlCl3谱带I紫移3040nm示B环有邻二酚羟基若紫移20nm示B环有邻三酚羟基带I紫移5065nm示A、B环均可能有邻二酚羟基AlCl3/HCl谱图=MeOH谱图示无3-及5-OHAlCl3/HCl谱图MeOH谱图示可能有3-及/或5-OH带I红移3555nm示只有5-OH无3-OH仅红移1720nm示除5-OH外，尚有6-含氧取代红移5060nm示可能同时有3-OH及5-OH,异黄酮、二氢黄酮（醇）的吸收峰（带II）位移规律,NaOAc异黄酮带II红移620nm示有7-OH二氢黄酮（醇）带II红移3437nm示有5，7-二OH带II红移5158nm示有7-二OH,AlCl3/HClAlCl3/HCl谱图与甲醇中的谱图比较异黄酮带II红移1014nm示有5-OH二氢黄酮（醇）带II红移2026nm示有5-OH,诊断试剂位移规律归属,查耳酮、橙酮的吸收峰（带I）位移规律,NaOMe查耳酮带I红移60100nm，强度增加示有4-OH带I红移60100nm，强度不增加示有2-或4-OH橙酮带I红移7095nm，示有或6-OH,AlCl3及AlCl3/HCl查耳酮、橙酮（AlCl3较AlCl3/HCl谱图）带I红移4070nm示有B-环邻二酚羟基查耳酮（AlCl3/HCl谱图较MeOH谱图）带I红移4060nm示有2-OH,诊断试剂位移规律归属,二1H-NMR谱在黄酮结构研究中的应用,测定溶剂：CCl4-样品需制备成三甲基硅醚化衍生物，不能显示羟基质子特征，目前已基本不被采用。DMSO-d6-样品（苷、苷元）不需制备成衍生物，可以显示各酚羟基质子特征。,A环质子B环质子C环质子糖上质子取代基团质子,芳环质子芳环质子与类型有关端基质子-OH、-CH3、其它质子-OCH3、,-OCOCH3,黄酮类化合物各质子的信号特征（、峰形状、J、峰面积）,68ppm，B-H位于较低场5-H最大8.0ppm（羰基去屏蔽）A-H5.77.95-OH12.40B-H6.57.97-OH10.93,1H-NMR谱在黄酮结构研究中的应用,J邻69Hz3-OH9.70J间23Hz4-OH(10.01)J对01Hz（不计）3-OH(9.42)峰形状及J与取代有关-OCH33.54.10(3Hs),6-CH32.042.27(3Hs),8-CH32.142.45(3Hs)A-环B-环-OCOCH3(羟基乙酰化)5，7-二OH4-氧取代糖上1.652.10(3Hs)7-OH取代3，4-氧取代苷元2.302.50(3Hs),3，4，5-氧取代glu,H-1位于低场较大4.85.70ppm依、峰形（d、dd）、J苷元-3-O-glu5.80左右（1H.d.）J与构型有关Jaa=69Hz，Jae=23A、B-环取代方式推断苷元-5、7、4-O-glu5.0左右rhaC-CH30.81.20(d/m),黄酮H-36.30（1H，s）黄酮醇C-环无质子异黄酮H-27.67.80（1H，s）受1-氧原子和4-羰基吸电影响,较大二氢黄酮H-2中心5.2(1H,dd.Jaa=11.0Hz,Jae=5.0Hz)两个H-3中心2.8(1H,dd.J偕=17.0Hz,Jaa=11.0Hz)(1H,dd.J偕=17.0Hz,Jae=5.0Hz)二氢黄酮醇H-24.85.0（1H，d.Jaa=11.0Hz）H-34.14.3（1H，d.Jaa=11.0Hz）查耳酮H-a6.77.40(1H,d.J反=17.0Hz)H-7.07.70(1H,d.J反=17.0Hz)橙酮=CH6.56.70（1H，s）,取代基团,1H-NMR谱在黄酮结构研究中的应用,三13C-NMR谱在黄酮类化合物结构研究中的应用,推断黄酮类化合物的骨架类型,（一）黄酮类化合物骨架类型的判断利用13C-NMR谱中黄酮类化合物的中央三个碳核信号的位置以及它们在偏共振去偶谱中的裂分情况,13C-NMR谱中黄酮类化合物结构中的中央三碳核的信号特征,C=OC-2（或C-）C-3（或C-a）归属,174.5184.0(s)160.5163.2(s)104.7111.8(d)黄酮类147.9(s)136.0(s)黄酮醇类149.8155.4(d)122.3125.9(s)异黄酮类182.5182.7(s)146.1147.7(s)111.6111.9(d)橙酮类(=CH-)188.0197.0(s)136.9145.4(d)116.6128.1(d)查耳酮类75.080.3(d)42.844.6(t)二氢黄酮类82.7(d)71.2(d)二氢黄酮醇类,（二）黄酮类化合物取代图式的确定利用黄酮类化合物中芳香碳原子（A-环碳原子、B-环碳原子）的信号特征,确定取代基的取代图式,黄酮母核13C-NMR信号归属,推断取代基（X）的连接位置依取代基的位移效应规律(B-环),XZiZoZmZp,-OH+26.0-12.8+1.6-7.1,-OCH3+31.4-14.4+1.0-7.8,确定5，7-二OH取代黄酮图式依5，7-二OH黄酮中的C6和C8信号特征90100ppm范围内C6C8,确定糖与苷元的连接位置依苷化位移规律,苷元（酚羟基）：a-C移向高场，降低邻、对位-C移向低场，增大糖（酚苷）：端基碳原子+4.06.0ppm,四MS在黄酮类化合物结构研究中的应用,黄酮类化合物MS特征测定分子量（M+）,取代基团推断（碎片离子峰）,苷元（极性小）苷（极性大、难气化、与热不稳定）,EI-MS（以前）：苷看不到，须制备成衍生物方能测得很弱的分子离子峰FD-MS、FAB-MS、ESI-MS（目前）：可测得分子离子峰或准分子离子峰M+1、M+23等。,可以测的分子离子峰，且常为基峰,EI-MS裂解规律1分子离子峰为基峰用于测定分子量。2主要碎片离子峰为裂解途径I和裂解途径II。,黄酮类化合物结构MS,裂解途径I（RDA裂解）：,裂解途径II：,通常，上述两种基本裂解途径是相互竞争、相互制约的。并且，途径I裂解产生的碎片离子丰度大致与途径II裂解产生的碎片离子的丰度互成反比。,黄酮类化合物结构MS,.,两种途径裂解得到的碎片离子A1、B1、B2等，保留着A-环、B-环的基本骨架，且碎片A1与相应的B1碎片的质荷比之和等于分子离子的质荷比。,母核推断A、B-环取代情况确定,3.其他碎片离子峰还有M-H+、M-CO+、M-CH3+（含甲氧基）、A1+H、A1-CO、B2-CO等碎片离子。,+,黄酮类基本裂解途径(以途径-I为主）,途径I+H转移,途径II,途径I,黄酮醇类基本裂解途径（以途径-II为主）,途径IH转移,途径-II,