RNA提取方法及原理.ppt

上传人:za****8 文档编号:2978284 上传时间:2019-12-05 格式:PPT 页数:29 大小:245KB
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RNA提取方法及原理,John,1、研究背景,1.1 RNA研究的重要性 DNA,RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子,是生命现象的分子基础。 DNA的遗传信息决定生命的主要性状,而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA,rRNA和tRNA,同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。,1.2 RNA分布,2、方法及原理,2.1 RNA的提取流程 1、样本前处理 2、细胞裂解 3、 RNA的纯化及获得,RNA提取流程 样品前处理注意点,选择新鲜血液,不得超过4小时,选择新鲜的幼嫩组织,选择处于生长旺盛的时期收集细胞,选择新鲜组织,生长旺盛的组织,可将新鲜血液先进行红细胞裂解,得到的白细胞 然后加入一定量的TRNzol,-70保存较长时间,去掉培养基,加入一定量TRNzol -70 保存较长时间,推荐使用专门的RNA样品 储存液进行储存,液氮或加入RNase抑制剂中保存, 避免反复冻融,RNA提取流程 样品前处理中如何保存样本,RNA提取流程细胞裂解,以释放RNA,异硫氰酸胍/酚TRNzol总RNA提取试剂,独特配方-RNAplant植物RNA提取试剂,胍盐/-巯基乙醇RNAprep系列RNA提取试剂盒,RNA提取流程 RNA的纯化及获得,RNA纯化要求,1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质 2 排除有机溶剂和金属离子的污染 3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 4 排除DNA分子的污染,2.2 RNA提取的注意事项 2.2.1 杜绝外源酶的污染 一:严格戴好口罩,手套。 二:实验所涉及的离心管,Tip 头,移液器杆,电泳槽,实验台面等要彻底处理。 三:实验所涉及的试剂/溶液,尤其是水,必须确保 RNase-Free。,2.2.2 阻止内源酶的活性 一:选择合适的匀浆方法。 二:选择合适的裂解液。 三:控制好样品的起始量。,2.3 Rnase 污染的10大来源 1:手指头 2:枪头 3:水/缓冲液 4:实验台面 5:内源 Rnase 6:RNA 样品 7:质粒抽提 8:RNA 保存 9:阳离子 (Ca, Mg) 10:后续实验所用的酶,2.4 几种RNA提取方法 2.4.1 TRIzol法 TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。,TRIzol法提取流程 1 样品处理: ()培养细胞:收获细胞 1-510 7 ,移入 1.5ml 离心管中,加入 1ml Trizol ,混匀,室温静置 5min 。 ()组织:取 50-100mg 组织(新鲜或 -70 及液氮中保存的组织均可)置 1.5ml 离心管中,加入 1ml Trizol 充分匀浆,室温静置 min 。 2 加入 0.2ml 氯仿,振荡 15s ,静置 2min 。 3 4 离心, 12000g 15min ,取上清。 4 加入 0.5ml 异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置 10min 。 5 4 离心, 12000g 10min ,弃上清。 6 加入 1ml 75% 乙醇,轻轻洗涤沉淀。 4 , 7500g 5min ,弃上清。 7. 晾干,加入适量的 DEPC H 2 O 溶解( 65 促溶 10-15min )。,细胞,实验流程图,细胞选择,贴壁细胞 悬浮细胞,2.4.2 苯酚法 细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在。因此,提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)的缓冲液中,加等体积水饱和酚,通过剧裂振荡,然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相,被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相,或者在两相界面处形成凝胶层。,苯酚法提取酵母RNA 取1g 活性干酵母在研钵中研碎,加10mL SDS-缓冲液使成匀浆,洗入各Eppendorf管(略少于管容积的一半),加溶菌酶0.1mL,混匀,室温静置10min,再加等体积饱和酚液,室温下剧烈振荡5min。置冰浴中分层,在0-4低温环境下,10000r/min 离心10min。吸出上层清液,转入新的Eppendorf 管,加等体积氯仿-异戊醇,室温下剧烈振荡2.5min,然后10000r/min 离心5min。,吸出上层清液,转入另一新Eppendorf 管,加2 倍体积95乙醇(含2乙酸钾),在冰浴中放置30min,使RNA 沉淀。再以10 000r/min 离心5min,弃上清液,沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次,即加乙醇或乙醚,迅速离心各1min,保留沉淀。倾去乙醚后,减压真空干燥,准确称重,记录。,2.4.3 异硫氰酸胍酚法 异硫氰酸胍酚法提取RNA的原理如下:GIT与巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性;GIT与 十二烷基肌氨酸钠 (Sarcosyl)作用使蛋白质变性,从而释放RNA;酸性条件下DNA极少发生解离,同蛋白质一起变性被离心下来,RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA,逆转录及构建cDNA文库。,异硫氰酸胍酚法提取植物组织总RNA 1) 取2g左右植物组织放入研钵中,反复加入液氮充分研磨至粉末状。加45mL异硫氰酸胍溶液。转移到小离心管中,每管0.5mL。 2) 置于冰上,顺序加入:50l 2mol/L NaAc , 混匀,0.5mL水饱和酚, 170l CI,混匀。置冰上15min。 3) 各管平衡后,4,12 000g离心20-30min。转移上清到另一管中,加入等体积的异丙醇,混匀,20沉淀30min-1hr或80沉淀10min。4,12 000g离心20min回收RNA。 4) 用70乙醇洗一次,4,12 000g离心5min。吸去乙醇,空气中吹干RNA沉淀。用150l 异硫氰酸胍溶液,65吹打RNA沉淀溶解。,5) 加等体积异丙醇20沉淀30min-1hr或80沉淀10min。4,12 000g离心20min回收RNA。 6) 用70乙醇洗两次后,吹干溶于适量的DEPCH2O中。部分分装后进行纯度及完整性的检测。其余加2.5倍体积乙醇沉淀于80冰箱中存放。 7) 紫外分光光度分析纯度和含量,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析完整性。,植物病毒的RNA提取,大多植物病毒RNA为单链RNA,并且其极性与mRNA极性相同,植物病毒RNA提取较为简单,一般使用酚氯仿即可获得满意结果。,一、材料 提纯TMV病毒液(10mg/ml)。 二、设备 冷冻台式离心机,低温真空干燥仪,电泳仪,电泳槽。 三、试剂 TE-饱和酚:氯仿(1:1),氯仿,3M NaAc(pH5.2),乙醇(100%和70%),TE缓冲液,无RNA酶的双菌水。,操作步骤,1、取一eppendorf管加入提纯TMV(10mg/ml)400ml,再加入等体积酚/氯仿,盖紧管盖后用手充分振荡1分钟,4下12000g离心10分钟。 2、吸取水相于一新eppendorf管,再用酚/氯仿抽提,直至水相和有机相交界面无蛋白为止。 3、吸取水相于新eppendorf心管,加入等体积氯仿,用手倒置离心管数十秒,4下12000g离心10分钟。,4、取水相,加入1/10倍体积的3mol/LNaAc(pH5.2),2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀,-2030分钟。 5、4下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀,4下12000g离心5分钟。 6、小心弃去上清液,沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟,并溶于无RNA酶的双菌水或TE缓冲液中。 7、取10ml进行电泳分析,另10ml用于cDNA合成。,动植物组织mRNA提取,一、材料 水稻叶片或小鼠肝组织。 二、设备 研钵,冷冻台式高速离心机,低温冰箱,冷冻真空干燥器,紫外检测仪,电泳仪,电泳槽。 三、试剂 1、无RNA酶灭菌水:用将高温烘烤的玻璃瓶(180 2小时)装蒸馏水,然后加入0.01%的DEPC(体积/体积),处理过夜后高压灭菌。 2、75%乙醇:用DEPC处理水配制75%乙醇,(用高温灭菌器皿配制),然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱。 3、1层析柱加样缓冲液;20mmol/L TrisCl(pH7.6),0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTA(pH8.0),0.1% SDS。 4、洗脱缓冲液:10mmol/L TrisCl (pH7.6),1mmol/L EDTA (pH8.0),0.05% SDS。,操作步骤,(一)动植物总RNA提取-Trizol法 Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交, Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆,1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。 3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。,4、弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4下7500g离心5分钟。 5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要时可55-60水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70。 注意 1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。 2、加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4保存一周,-20保存一年,谢谢,
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