岛津液相色谱常见问题及其对策.ppt

欢迎参加岛津液相维修培训班,采用 “HPLC” 级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配,流动相的选择,其他问题,其他问题,水的等级 纯化水 蒸馏水 去离子水,波长 (nm),纯化水,去离子水,因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高,纯化水中去除了无机和有机的污染物,吸光率,其他问题,水 / MeOH梯度 ODS 柱,鬼峰,Gradient Curve,1 ml/min, 0-100% MeOH over 10 mins and hold for 15 mins.,鬼峰的出现,其他问题,溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯,都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒,优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,微量分析、梯度洗脱,其他问题,甲醇 乙睛 正己烷,分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图,其他问题,溶剂的过滤 滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。 醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂,脱气： 除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动,其他问题,脱气的目的,1. 防止由气泡的产生引起的故障 2. 防止由溶解（在液体中的）气体量 的变动引起的检测不稳定程度 1）示差折射率检测器 *使折射率变化 2）UV检测器（200nm以下） *溶解氧气有吸收 3）荧光检测器 *溶解氧气有消光作用,其他问题,其他问题,脱气的方法,1. 超身波脱气法 2. He清除法 3. 使用氟树脂膜的减压脱气法,其他问题,He清除法,调压阀,排气阀,往送液泵,流动相,过滤器,其他问题,氟树脂膜,真空室,往送液泵,真空泵,控制器,流动相,使用氟树脂膜的减压脱气法,梯度洗脱法,梯度洗脱装置： 高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入 低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。 梯度洗脱： 优点： 可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度,梯度洗脱法的注意点,溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器） 查看空白实验的数据。 遵守分析周期。（最初的分析数据不采用）,样 品 处 理,1. 使用流动相溶解样品 - 减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要 - 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀,其他问题,缓冲液,选择缓冲液的步骤 1 .确定最佳分离状态时的流动相pH 2 .选择具有与流动相的pH相近的pKa 的缓冲液 （即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液） 3 .确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收 （在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和 柠檬酸的缓冲液）,一些代表性弱酸的pKa,pK1 pK2 pK3 醋酸 4.87 柠檬酸 3.13 4.76 6.40 磷酸 2.16 7.2 1 12.32,其他问题,缓冲液的使用,使用前必须过滤 使用后一定要进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损、阻塞: 用纯水冲洗30-60min（1ml/min），再用甲醇冲洗30min 易受到细菌和霉菌的影响,不能直接用有机溶剂冲洗,液相色谱容易出问题的部件,维护流程图,吸滤头,单向阀,柱塞密封圈,线路过滤器,手动进样器,检测器,管线选择,材料 不锈钢 Teflon PEEK (聚醚酮) 尺寸 0.1 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.5 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.8 mmI.D. x 1.6 mmO.D.,管线材料,不锈钢 (可用于所有连接) 能承受几千 kg/cm2 压力 酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 (尤其在pH小于2时) PEEK (可用于所有连接) 能承受高达 250 kg/cm2压力 可在整个PH范围(pH 1-14)内使用 不适用于高溶解性溶剂如氯仿等 Teflon (用于柱后阻尼管、反应管和排液管) 化学惰性大 能承受 5 kgf/cm2 压力,材料：不锈钢烧结，孔径10um 故障：堵塞 表现：管路中不断有气泡生成 措施：用520的稀硝酸，超声波清洗， 再用蒸馏水清洗 注意点：吸滤头拆下时不必将塑料管剪断,吸滤头,液相色谱容易出问题的部件,LC-10ATvp泵：串联 式往复泵,LC-10ADvp泵：并联式 往复泵,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,单向阀结构,流动相,单向阀原理,液相色谱容易出问题的部件,故障1：宝石球粘附于垫片 表现：泵无法吸液或排液，流路不通 措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压， 使宝石球与垫片分开 2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中， 用超声波清洗,单向阀,液相色谱容易出问题的部件,故障2：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好 表现：系统压力波动大 措施：拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超 声波清洗,单向阀,故障：密封圈磨损而导致 密封不良 现象：系统压力波动大或 漏夜措施：更换密封圈 注意点： 更换密封圈 拆卸泵头前，柱塞杆 复位 （PSET）,柱塞密封圈,液相色谱容易出问题的部件,故障：堵塞 现象：系统压力波动大或压 力偏高 措施：5稀硝酸，超声波清 洗 判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速1mL/min，如压力3kgf/cm2，则可能堵塞。,线路过滤器,排液阀,压力传感器,线路过滤器,流动相,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,进样器,自动进样器 手动进样器 原理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入,液相色谱容易出问题的部件,进样量和检测器响应的关系示意图,进样体积,检测器响应值,定量环体积的一半,3倍定量环体积,全量注入,部分注入,手动进样器的原理图,装填状态,进样状态,交叉污染的原因,便捷的方法（不需清洗） 1.进样状态下插入微量注射器 2.切到装填状态 3.注入样品 4.切回到进样状态,手动进样法,操作注意点： 1）插针应插到底 2）进样应使用液相色谱专用平头进样针 3）清洗应使用专用针口清洗器,手动进样器,定子,转子,塑料箍,弹簧,不锈钢套,液相色谱容易出问题的部件,手动进样阀 故障：转子密封损坏 现象：漏液 原因：a 拧的太紧 b 样品太脏 c 针头损坏或不使用液相专用针 解决措施：更换转子密封，并在使用,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,手动进样阀 故障：载样困难 原因：a 定量环堵塞 b 进样器污染 解决措施：清洗或更换定量环、进样器,液相色谱容易出问题的部件,分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性,柱子 故障：系统高压、峰型变差（拖尾峰、前沿峰、分叉峰），保留时间的改变 解决措施：清洗 正相柱，正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇 反相柱，甲醇、乙腈、氯仿、异丙醇、0.05M稀硫酸,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,峰产生有肩或分叉的原因,1. 柱子劣化 （进口处产生不均匀的空隙） 2. 样品劣化 （生成氧化物、分解物等）,判断标准 所有的峰都产生有肩峰或分叉时则为柱子劣化,延长柱寿命方法： 倒冲柱 换过滤片 修补柱头,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,柱的补修,填料的取出,液相色谱容易出问题的部件,恢复例,液相色谱容易出问题的部件,硅胶基底,聚合物基底,pH 范围,2 - 7.5,宽范围,有机溶剂,所有,有限制,压力, 250 kgf/cm2,低压,温度,宽范围,60C,色谱柱的类型及适用范围,液相色谱容易出问题的部件,分 析 柱 的 维 护,在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下 (0.2-0.3 ml/min)冲洗 30 mins，长时间未用的分析柱也要同样 处理 定期使用强溶剂冲洗柱子 3、使用缓冲盐时，要先用水冲洗，再用有机溶剂冲洗 4、净化样品 5、分离条件 6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯 7、使用预柱 8、避免流动相组成及极性的剧烈变化 9、避免压力脉冲的剧烈变化,液相色谱容易出问题的部件,柱压低于150kgf/cm2 柱温在40左右，最高使用温度为50 缓冲液PH使用范围为27 流动相有机溶剂比例过低, 柱效下降快,硅胶在PH为34时稳定性最好 碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。,ODS柱的使用注意点：,液相色谱容易出问题的部件,紫外检测器,参比池,样品池,光线,光电倍增管,液相色谱容易出问题的部件,更换氘灯（紫外检测器）,判断氘灯能量： 设定220nm波长，检查参比池能量，如 能量低于800，需更换氘灯。 操作注意点： 不要用手直接接触氘灯表面,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,故障：样品池受污 表现：样品池和参比池能量相差较大 检查方法：设定250nm波长，通甲醇或水，查看SMPL EN和 REF EN，如两者相差较大，则样品池受污。 措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重， 拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中超声波清洗。,紫外检测器,示差折光检测器,原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。 优点：通用型检测器， 缺点： 1）对温度变化敏感 2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测 3）属于中等灵敏度的检测器,液相色谱常见问题及其对策,液相色谱常见问题类型 A. 压力异常（偏高、波动） B. 漏液 C. 保留时间漂移 D. 基线问题（漂移、噪声） E. 峰形异常,现象：无压力，流动相不流动 可能原因 1、保险丝断或电源问题 2、柱塞杆折断 3、泵头内有空气或流动相不足 4、单向阀损坏 5、漏液 6、压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力),压力异常,现象：压力持续偏高或不断上升 1、流速设定过高 2、保护柱或柱子筛板堵塞 3、流动相使用不当或有缓冲盐析出 4、色谱柱选择不当 5、进样阀损坏 6、线路过滤器堵塞,压力异常,压力异常,现象：压力持续偏低 1、流速设定过低 2、色谱柱选择不当 3、柱温过高 4、系统漏液,现象：压力持续偏低 1、流速设定过低 2、色谱柱选择不当 3、柱温过高 4、系统漏液,压力异常,压力异常,现象：压力波动 可能原因 1、泵头中有气泡 2、单向阀损坏 3、柱塞密封圈损坏 4、脱气不充分 5、系统漏液 6、使用了梯度洗脱,漏液,接头处漏液 1、接头处松动 2、接头磨损 3、接头被污染 4、部件不匹配,漏液,泵漏液 1、单向阀松动 2、泵密封损坏 3、放空阀损坏 4、接头松动（不要拧的太紧）,漏液,泵漏液 1、单向阀松动 2、泵密封损坏 3、放空阀损坏 4、接头松动（不要拧的太紧）,进样阀漏液 可能原因 1、转子密封损坏 2、定量环堵塞 3、进样口密封松动 4、进样针尺寸不合适 5、废液管产生虹吸 6、废液管堵塞,漏液,检测器漏液 可能原因 1、流通池垫片损坏 2、流通池透镜破碎 3、手紧接头处漏液 4、进样针尺寸不合适 5、废液管堵塞 6、流通池堵塞,漏液,保留时间漂移 可能原因 1、柱温变化 2、流动相组分变化 3、色谱柱没有平衡 4、流速变化 5、泵中有气泡 6、流动相选择不当 7、键合相流失 8、缓冲容量不够,保留时间漂移,基线漂移 可能原因 1、温度波动 2、流动相不均匀(脱气，使用纯度更高的溶剂) 3、流通池被污染或有气泡 4、流通池窗口破裂 5、流动相配比不当或流速变化 6、柱子平衡（约3060min）,基线问题,基线漂移 可能原因 7、流动相污染，变质或由低品质溶剂配成 8、样品中有强保留的物质以馒头样峰被洗出 9、检测器没有设定在最大吸收波长处,基线问题,基线噪声（规则的） 可能原因 1、流动相、泵、检测器中有气泡 2、有地方漏液 3、流动相混和不均匀 4、温度影响（检测器和柱温差别太大） 5、其他电子设备的影响,基线问题,基线噪声（不规则的） 可能原因 1、流动相污染、变质或由低质溶剂配成 2、有地方漏液 3、流动相各溶剂不相溶或混和不均匀 4、流通池污染 5、检测池能量不足 6、系统内有气泡,基线问题,前沿峰、拖尾峰 可能原因 1、柱塞板堵塞 2、色谱柱塌陷 3、柱外效应 4、干扰峰 5、缓冲不足或不合适 6、化学或次级保留（硅羟基效应）,峰形异常,前沿峰、拖尾峰 可能原因 7、重金属污染 8、样品溶剂选择不当 9、样品过载 10、柱温过低,峰形异常,分叉峰 可能原因 1、保护柱或分析柱污染 2、样品溶剂不溶于流动相,峰形异常,峰展宽 进样体积过大 流动相粘度过高 检测池体积过大 保留时间过长 柱外体积过大 样品过载,峰形异常,峰变形 可能原因 1、样品过载 2、样品溶剂选择不当,峰形异常,鬼峰,1、进样阀残余峰 2、样品中未知物 3、柱未平衡 4、水污染 5、三氟乙酸氧化,