前列腺癌方面免疫组化基础知识.ppt

前列腺癌的免疫组化标记物,发表时间：2013-5-13 来源：中外健康文摘2013年第10期供稿 作者：胡新梅 于民 姜敏,1 前列腺特异性抗原 前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)是分子量34000的单链糖蛋白，由237个氨基酸构成，它是一种丝氨酸蛋白酶，使凝固的精液溶解、液化。它是在1979年作为前列腺腺上皮细胞的标志物被发现的。血清PSA目前已被广泛应用于前列腺癌的早期筛查。,PSA在正常前列腺、前列腺增生、前列腺癌、前列腺上皮内瘤，均呈阳性表达，定位于上皮细胞的胞质中，而在前列腺转移癌则呈阴性表达，因此PAS阳性提示肿瘤来自前列腺上皮，可用于区分前列腺癌与前列腺转移癌5。PSA在前列腺良、恶性病变中均呈阳性表达，故PSA不能用于鉴别良恶性病变。几乎所有的前列腺癌（除了分化最差的癌和少数激素治疗后复发的进展期癌以外）PSA标记都阳性，而高分化前列腺癌的PSA表达强于低分化前列腺癌, 表明PSA表达与分化程度有关。而对于分化很差的癌，即使PSA阴性也不能完全排除前列腺癌，还要结合其他检查综合考虑。偶尔PAS阳性可出现在前列腺以外的组织和肿瘤，但一般为局灶性弱阳性 6。,5Harvey AM, Grice B, Hamilton C, et a1. Diagnostic utility of p504s/p63 cocktail, prostate-specific antigen, and prostatic acid phosphatase in Verifying prostatic carcinoma involvement in seminal Vesicles: a study of 57 cases of radical prostatectomy, speciments of pathologic stage pT3bJ. Arch Pathol Lab Med,2010,134(7):983-988. 6Bostwick D G, Qian J, Ramnani D M. Immunohistochemistry of the prostate and bladder, testis and renal tumors. In: Dabbs D J, ed. Diagnostic Immunohistochemistry. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2002.407-33,CK34El2,1984年，Gown等7首先报道了CK34El2，它是一种高分子量5700066000的细胞角蛋白。CK34El2标记良性前列腺组织，仅在前列腺基底细胞的细胞膜以及细胞质中表达，而不在前列腺分泌上皮细胞表达，故CK34El2可作为对前列腺的基底细胞层进行选择性的标记8。由于基底细胞消失是诊断前列腺癌的重要形态学依据，而苏木素-伊红染色切片判断基底细胞是否存在常十分困难，因此用CK34El2标记基底细胞就成为前列腺良恶性鉴别诊断的重要手段之一。,在正常和良性增生以及上皮内瘤的前列腺腺体，导管周围形成连续或断续的CK34E12分布。而前列腺癌的腺体的基底细胞层完全消失，所以最终表现为CK34E12不表达。但CK34E12标记基底细胞可部分阴性，对经尿道电切的标本，常因标本经人为烧灼而受影响，因此可靠性和稳定性欠佳。有20%30%的前列腺癌导管腺癌和筛状癌周围有连续或间断的基底细胞，而部分良性前列腺病变,如腺病和不完全性萎缩的腺泡周围基底细胞可部分甚至完全消失。说明基底细胞消失并非诊断前列腺癌的绝对指标。而免疫组化操作不当，则有可能出现假阴性结果而误诊。故免疫组化结果应结合HE切片中的其他形态学特征综合判断。,P63,1998年，Okada等9分离出新基因P63，P63是P53抑癌基因家族的成员，位于人类染色体3q27-29。P63能特异性地标记前列腺基底细胞，呈胞核阳性，棕黄色颗粒状，故而可以显示基底细胞的存在，而前列腺的分泌上皮细胞则呈阴性10。绝大多数的前列腺良性增生及低级别上皮内瘤的腺体的周围呈现连续性的P63分布；而高级别上皮内瘤可见P63不同程度的间断消失，而前列腺癌中腺体周围P63为阴性，显示基底细胞已经完全的消失。因此，P63也可用于前列腺癌的鉴别诊断。,CK34E12、P63均可用于标记基底细胞，而作为诊断前列腺癌的有力手段。P63与CK34El2相比，具有以下优点：部分CK34E12标记阴性的基底细胞，P63标记可呈阳性；对有烧灼的经尿道电切的前列腺标本，P63标记结果比较稳定。P63标记基底细胞呈核阳性，结果容易判断，背景比较清晰。缺点则是其阳性表达是间断的，当可疑腺泡少时，判断其基底细胞是否消失有时比较困难。在实际应用中，两者具有互补作用。,基底细胞消失是前列腺癌的重要诊断依据，但局部的基底细胞缺失却不能作为诊断前列腺癌的唯一标准。由于前列腺癌可有残留的基底细胞，而且浸润性癌在管腔内扩散及良性腺体陷入癌组织中11,因此个别前列腺癌中CK34El2与P63亦有阳性表达。少数前列腺增生病变基底细胞标记亦呈阴性表达，说明少数前列腺良性腺体基底细胞可以不连续或不能被证实存在，这也提示基底细胞免疫标志物阴性不能单独作为确诊恶性的指标。,-甲基-辅酶A-消旋酶 (P504s),2001年Jiang等12首次将P504s抗体应用于前列腺癌的诊断。P504s即-甲基-辅酶A-消旋酶(alpha-methylacyl-CoA racemase)，其基因定位于染色体5P13，它所编码的蛋白由382个氨基酸组成，在支链脂肪酸的-氧化和衍生过程中起作用。P504s在前列腺癌中高表达，而在正常中前列腺组织中则呈阴性或灶性弱阳性。Jiang等在所检测的137例前列腺癌中阳性率高达100%，并提出P504s是前列腺癌高度敏感性和特异性的标记物。,P504s阳性，CK34El2和p63阴性，能从正反两面支持前列腺癌诊断，从而大大提高前列腺癌的诊断正确率13。然而，临床上并非所有的前列腺癌都是P504s阳性，CK34El2及p63阴性，也并非所有的前列腺良性病变都是P504s阴性，CK34El2及p63完整阳性。杨京哲14等人的试验中，P504s不仅在前列腺癌中有高表达，而且在前列腺上皮内瘤中也高表达，这表明P504s不但对前列腺癌敏感，并且对PIN也非常敏感，故用P504s只能区别前列腺良性增生，而不能把前列腺癌和PIN鉴别开来。,2004版 WHO中， P504s在前列腺癌的阳性率为80%以上，但在某些前列腺癌如泡沫状腺癌、萎缩性癌、假增生性癌和治疗后前列腺癌中阳性率比较低。而且P504s在12%的良性增生，17.5%的前列腺腺病，萎缩型腺体以及90%以上的高级别PIN中呈阳性反应。此外，P504s在前列腺以外的肿瘤如尿路上皮癌、结肠癌、肾癌以及良性肾源性腺瘤也可阳性。这表明P504s没有组织特异性，不是前列腺癌的特异性标志物。,综上所述，免疫组化在前列腺癌诊断中的应用具有重要价值，但决不能完全依靠免疫组化去诊断前列腺癌，单独的P504s(或基底细胞标志物)阳性或阴性均不能确诊前列腺癌。只有将组织病理形态与免疫组化染色结果结合起来，全面分析，综合判断，才能有效地避免误诊。,免疫酶细胞化学实验技术-实用免疫细胞与核酸技术（周德山）,免疫酶细胞化学是免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）中最常用的方法之一，它是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学的手段，检测某种物质（抗原/抗体）在组织细胞内存在部位的一门新技术：即预先将抗体与酶连结，再使其与组织内特异抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电子显微镜下观察分析的形态学研究方法。,为克服荧光抗体法的不足、并能在超微结构水平定位抗原物质的存在部位，Nakane(1966)等成功地引入了酶代替荧光色素标记抗体，进行组织细胞内抗原或半抗原的定位，开辟了酶标抗体技术免疫酶细胞化学之路。 结合笔者经验，介绍ICC染色中的主要程序：组织标本的固定、切片、染色原理及步骤、结果判定及一些进展、特殊应用等供读者参考。,第一节 固定和切片,一、固定 若想得到理想的ICC染色结果、正确地判断抗原物质在组织细胞内的位置，除需有良好酶和抗体外，保持组织细胞内抗原物质的不动性（Immobility）和免疫活性也是至关重要的。换言之，如果抗原物质在组织细胞间弥散、丢失或失去免疫活性，无论如何努力染色都是徒劳的，所以说固定是ICC染色中非常重要的一环。ICC与其它组织学技术不同，除要求保存良好的结构外，还需保存组织抗原的免疫活性。一般认为，新鲜组织能够最大限度地保存组织抗原的免疫活性，但结构较差，易出现抗原弥散丢失现象。,Cumming（1980）报告，不固定的组织切片ICC染色时，环鸟苷酸含量丢失80%以上。固定的目的是使构成组织细胞成分的蛋白等物质不溶于水和有机溶剂，并迅速使组织细胞中各种酶降解、失活，防止组织自溶和抗原弥散，保持组织细胞的完整性和所要检测物质的抗原性。因此迅速充分固定是ICC染色成功的关键一步。用于ICC的固定剂种类较多，选择时应根据所要检测物质的抗原性质和切片方法以及所用抗体特征等做最佳筛选。制片及固定方法见第一章 ，下面介绍两种近年报道的新方法。,1AMEX（Acetone Meth Enzoate Xylene ）法 是改良的冰冻置换法（freeze substitution）的简称，主要用于石蜡包埋标本。Sato(1986)报告，该法具有同新鲜（未固定）组织冰冻切片同样的抗原保持性和石蜡切片的良好组织结构保存。其机制为：组织在丙酮中固定（脱水），组织细胞内水份逐渐被丙酮取代，继之，用苯甲酸酯取代组织内丙酮，经二甲苯置换后，石蜡包埋。组织在-20丙酮内过夜亦形成冰晶，所以原方法将组织先置4丙酮2030min，再移入-20丙酮过夜。实际上组织在4丙酮内过夜亦可得到同样效果。如在该固定液内加入少量蛋白酶活性阻断剂，并采用低溶点石蜡包埋等，可获得更佳染色结果。,微波固定（Microwave fixation）,为近几年所注目的问题之一。该方法能保持良好的组织结构和抗原性，适于各种切片的酶组化、ICC以及免疫电镜等材料固定。其固定机理可能与微波（频率10003000MHz）具有被水分吸收的性质（通常所用的微波是频率2450MHz，波长12cm）；生物材料含有大量水份，照射后，温度升高，分子运动加快，促进固定液向组织内渗透，加速与组织成分的反应，短时间内达到固定的效果等有关。经微波照射固定的组织，需置相同固定液中，继续固定26h，室温。,二、切片,光镜ICC染色，常用的有冰冻切片和石蜡切片两种，二者各有其优缺点，应根据抗原的性质、实验室条件，合理选择之。对未知抗原显示时，最好同时应用。冰冻切片为ICC研究所首选。,Shi（1991）等报告：微波炉照射的切片，能够激活部分核内抗原活性。其机制不清，可能与高温、高热的作用，使核内DNA双链解开，DNA、RNA解离，抗原暴露有关。其步骤为：将切片脱蜡水洗后，置染色瓶中，加入去离子水或缓冲液至瓶颈处，反复多次照射，每次1min，照射510次，每次照射后，补充瓶中蒸发掉的液体，照射温度不超过9095为宜。此处理后，细胞核染色以苏木精为佳,第二节 染色方法,一、本科标抗体法 酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。,（一）酶的种类及特点 从理论上讲，用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗体，进行ICC染色，但实际上在ICC中所能用的酶并不多。现将常用的几种酶列于表4-1，供选用时参考。,Sternberger(1986)指出，用于标记的酶应具备以下几点酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察；所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位；较易获得的酶分子，最好有商品出售；中性pH时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存12年活性不应改变，且酶的催化活性（Turnover）越高越好；酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性；被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。,（二）本科标抗体的制备（Boosma,DM, 1983）,酶标抗体与荧光色素标记抗体不同，它需借助桥-偶联剂的作用，将酶连结在抗体分子上。偶联剂是一种双功能试剂，具备3个基本特征：偶联剂与抗体和酶之间的连结，必须是不可逆的，即借共价键连结；偶联剂不应影响酶和抗体的活性；不能因偶联剂的加入，使酶与组织成分了生非特异结合。 抗体制作步骤未列出,（四）染色原理及步骤,1基本原理 酶标抗体与荧光色素标记抗体的染色相同，亦分直接法和间接法。直接法是将酶直接标记在每一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。间接法所用的第一抗体是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体（80%90%的抗血清系由家兔制得，而绝大数单克隆抗体系由小鼠制备）；第二抗体则为第一抗体（家兔/小鼠的IgG）的抗体。所以，只要不同的第一抗体均来自同一种属，同一标记的第二抗体就能用来显示其不同特异性抗原的存在，这样可避免了直接法中标记每一种第一抗体的麻烦，并且提高了方法的敏感度。目前的ICC染色中，以间接法为常用，在此着重介绍间接法的染色程序。,2染色程序,（1）切片准备：见第一章 。 石蜡切片经二甲苯或Hemo-De脱蜡，下行酒精至水。固定/无固定新鲜组织冰冻切片，室温干燥2h以上。 （2）未固定的新鲜组织切片，丙酮固定2030min(fretrieval )，简而言之，即用蛋白酶处理，去除固定剂交联造成的空间遮蔽（室温），风干1530min.;已固定的组织冰冻切片及石蜡切片，根据需要可进行组织抗原的激活。,（3）用蜡笔沿切片周围勾划一道屏障，以避免孵育液流失及孵育过程中切片干燥，同时也能节 省抗体用量，保持切片与抗体的充分接触，风干。石蜡切片（滴少量PBS，以防其干燥）直接进行步骤（6）。 （4）切片经PBS或其它缓冲液漂洗3次，每次2min，溶解除去冰冻切片上的OCT包埋剂。但应用ALP标记抗体时，禁用二甲胂酸钠缓冲液漂洗，因后者可使ALP失活。 （5）根据需要，用甲醇+0.3%H2O2处理切片1530min（室温），封闭内源性过氧化酶的活性。应用ALP标记抗体时，此步可省略。,（6）PBS漂 洗2min（共两次），移至0.05%Tween-20/PBS(或0.221%Triton X-100)中5min（室温）。Tween-20为一种表面活性剂，除具有清洁作用外，还可增加组织的通透性，有利于组织细胞内抗原的显示。 （7）4%Block Ace或0.1%1%BSA湿盒内孵育1525min（室温），然后；轻轻弃去孵育液（不冲洗）；以阻断组织与抗体的非特异性结合，降低背景染色。 （8）根据需要，可用1/51/30正常来活兔/羊血清孵育1520min（室温，以酶标抗体相同种属正常血清为宜，最好是同一动物免疫前的血清）。或者省略此步，而在稀释酶标抗体时，加入1%2%的同一种属正常血清。,9）轻轻弃去孵育液， 滴加含0.2%BSA/0.05 NaN3/PBS稀释的第一抗体（抗体用量：每张切片一般为5080l），湿盒内孵育12h（2025）；免疫电镜用标本，4过夜。 （10）PBS充分冲洗（3次2min），以去除切片上非特异吸附的抗体。应用不同的第一抗体或同时进行对照标本染色时，需分别冲洗，以防相互污染。 （11）经0.05%Tween-20/PBs 2min后,滴加含0.2%BSA/1%正常血清/PBS稀释的HRP酶标记的第二抗体,湿盒内孵育4560min(2025)。,（12）PBS漂洗（3次2min）,此处不需分别漂洗，因所有切片均系同一酶标抗体孵育。 （13）未固定或固定较弱的冰冻切片，此处可轻微固定。首先将切片从PBS移至TBS中35min，去除PBS，以防其中的磷酸与后面使用的固定液中的CaCl2形成磷酸钙而沉淀后，然后用Baker氏固定液固定5min（室温）此时轻微固定，既不影响抗原抗体结合，又较有利于保存第一抗体孵育前的组织抗原，尤其适用于单克隆抗体的ICC染色。,（14）呈色：HRP标记抗体的呈色液为0.01%0.1%H2O2 0.01%0.05% DAB 0.050.1mol/L Tris HCl(pH7.4)。切片经PBS或Tris-HCl液漂洗后，置上述呈色液内1015min（室温、暗处），亦可镜下控制显色速度。终产物为棕褐色沉淀。用于电镜观察的标本，呈色35min即可，防止DAB终产物向周围扩散，影响超微结构定位。另外，显色液应于用前新鲜配制，避免DAB本身氧化变质。新配制的DAB为无色透明液体。若DAB液已氧化变为紫红色，应换新药重新配制。 （15）将切片置流水中（仅光镜观察）或PBS（电镜标本）内，终止呈色反应。 （16）未固定的冰冻切片，可用1%戊二醛-PBS液加强固定510min（室温），流水冲洗。,17）细胞核轻度染色，以甲基绿和苏木精为常用。前者细胞核呈绿色，与HRP/ALP等终产物对比度尤佳，但不适于微波照射的标本。苏木精是组织学、病理学研究中普遍应用的核染色方法，与HRP、ALP的终产物对比度比较好。 （18）DAB呈色的标本，可以系列酒精脱水、Hemo-De透明、DPX封固。其它物质呈色的标本，在有机溶剂中沉淀物易溶解，褪色，所以用水溶性封固剂如明胶甘油等封固，次日，于盖玻片周围涂少许女士用指甲油，可使切片保存时间更长。 （19）镜检、观察记录同一般形态学研究。 （20）免疫电镜用标本，经OSO4后固定，按电镜标本要求处理（参见本书第七章 ）。亦可OSO4固定，喷碳（Carbon Coating）,利用扫描电镜观察抗原的存在部位。,免疫组化的试剂准备,最重要的是选择好一抗、二抗或者还有三抗，注意抗体的特异性、效价和交叉反应，最好用单抗。 其他常用试剂有： 1、0.01M(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），稀释抗体和洗片子用； 2、清洁液、纯水，洗玻片用 3、多聚赖氨酸处理载玻片，防止脱片 4、固定液：4%多聚甲醛或冷丙酮等； 5、15%30%蔗糖，组织脱水用；,6、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，或者OCT包埋做冰冻切片； 7、抗原修复液：枸橼酸缓冲液（pH6.0）； 8、活化剂：EDTA或者Triton X-100； 9、1%10%牛血清清蛋白（BSA）封闭液； 10、H2O2，灭活内源性过氧化物酶； 11、显色液：根据你做的酶来选择，如果是HRP就用DAB，如果是AKP，就用NBT/BCIP，免疫荧光则不需要； 12、50%缓冲甘油封片液。,免疫细胞化学常用试剂介绍,