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实验八 大肠杆菌生长曲线的测定,1,目的要求,学习摇瓶培养方法 学习生长曲线的测定方法,2,大多数细菌在适宜的条件下培养通常经历延迟期,对数期,稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。 本实验用分光光度计进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线。,基本原理,3,大肠杆菌 LB培养基（全班配1000mL，每小组分装两瓶，50ml/瓶） 分光光度计，无菌试管，无菌枪头，比色皿等,器材,4,操作步骤,1、两个小组合作，准备4个装有50mL的三角瓶，空试管12支，枪盒等包装灭菌 2、斜面菌种接一环于两瓶LB培养基中，摇床37，200r/min振荡培养 3、每隔两小时从两只相同的摇瓶中各取1mL培养液入已灭菌的空试管（同一根试管）中作好标记，检测其OD600，或测得值过高，则需稀释适当倍数。 4、共测定12个样，即接种0时，2时，4时，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24时的OD600 ，列表并以时间为横坐标， OD600为纵坐标作图，并标出生长曲线的各个时期。,5,5、半夜如何取样？ 实验结果：列表和绘制生长曲线,6,实验九 环境因素对微生物的影响,7,掌握混和倒平板的方法 了解紫外线对微生物的杀菌作用 了解常见生化因素对微生物的影响。,目的要求,8,基本原理,物理因素：紫外线引起细胞核酸变性，对微生物具有致死作用。紫外线的穿透力很弱，仅限于物体表面或空气灭菌。经紫外线照射后的受损细胞，遇光有光复活现象，需避光培养。 化学因素：常用的化学消毒剂主要有重金属及其盐类，酚、醇、醛等有机化合物以及染料、表面活性剂等。它们的杀菌或抑菌作用主要是使菌体蛋白质，核酸变性，或改变细胞膜的通透性等。 生物因素：某些抗生素只对少数细菌有抗菌作用，如青霉素一般只抗G+，多粘菌素只抗G-，这类抗生素称为窄谱抗生素；而另一些抗生素，如四环素、土霉素对许多G+和G-都有作用，这类抗生素称为广谱抗生素。,9,实验材料,菌种:每组做两种菌，分别为：一株已知菌（大肠杆菌（左边六组）或金黄色葡萄球菌（右边六组） ）和一株未知菌（脂肪酶产生菌） 培养基：LB固定培养基 化学消毒剂:75酒精，无水酒精，533消毒液，碘液,汞溴红溶液,生理盐水（对照）； 抗生素:青霉素，制霉菌素,阿奇霉素,头孢拉定,生理盐水（对照）； 需灭菌的材料（每小组）：镊子，培养皿6个，灭菌五角星牛皮纸两张和圆滤纸片若干（直径不大于1cm, 置于空平皿中灭菌），装5mL水的试管2支。,10,方法与步骤,1、制备含菌平板： （1）培养基配制：配制LB固体培养基（每两小组300mL，分装于两只250mL三角瓶内。） （2）灭菌：121,20分钟（需同时准备的无菌材料见上页） （3）菌悬液配制：5mL无菌水分别倒入两株菌的斜面，接种环将菌苔刮下，制成菌悬液后倒回试管（原来装无菌水的试管），吹吸均匀，备用 （4）倒平板：取0.5mL菌悬液加入无菌空平皿中央，灭菌的固体培养基冷却至45-50，倒平板，缓慢混匀，标记菌号，静置冷却（已知菌和未知菌分别倒3个平板（分别用于紫外，化学药剂和抗生素实验），每小组共6个平板）,11,2、紫外线杀菌试验 (1) 紫外灯预热20分钟 (2) 取已冷却凝固的平皿2只（未知菌），分别用无菌镊子夹取已灭菌的五角星图案纸放在平皿中央。 (3) 紫外照射：将平皿置于紫外灯下，打开皿盖，照射5分钟，不开灯取出，用报纸包好置于28下培养48hr后观察结果。,12,3 化学药剂对微生物的影响 (1)将灭菌滤纸片浸入供试药剂中 (2)平皿分区:分别取已知菌与未知菌的平皿各一只，分为六个区,在背面做好标记 (3)加药剂：用无菌镊子夹取浸药滤纸片（注意把药液沥干，可在无菌的滤纸上沾一下）分别平铺于对应的区间内，注意药剂之间不要互相沾染。 (4)培养：两只平皿置于28下培养48hr后观察结果。,13,14,4 抗生素对微生物的影响 方法同3，采用不同的抗生素,15,思考题,只被紫外线照射和被紫外和可见光分别照射过的平板上菌落的生长情况有何不同？为什么？ 化学药剂对微生物所形成的抑菌圈是否说明微生物细胞已被杀死？ 能否通过你或同学做的实验结果对未知菌做个初步判断？,16,
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