westernblot总结前人的经验.ppt

Western blot,1.实验的原理 2.试剂的配制 3.实验的步骤 4.凝胶图象分析,实验的原理,实验室所用的试剂的配方参考TAKARA分子实验常用配方手册,试剂的配制,蛋白样品的制备 SDS-PAGE 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,实验的步骤,蛋白样品的制备,参考RIPA 裂解液的说明书： 对于培养细胞样品： 1.取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入 PMSF，PMSF 的工作浓度为 1X 2.对于贴壁细胞，去除培养液，用 PBS、生理盐水或无血清培养液洗两遍。加入适量的裂解 液（约为细胞体积的 5-7 倍），用移液器吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。冰上放置20min，14000g 离心 10 分钟，取上清，即为 蛋白提取物。,3 .对于悬浮细胞，2500g离心5min收集细胞，用 PBS、生理盐水或无血清培养液漂洗细胞，2500g离心5min收集细胞,加入适量裂解液. （约为细胞体积的 5-7 倍）。用移液器吹打数下，把细胞吹散，冰上孵育20min，14000g 离心 10 分钟，取上清，即为 蛋白提取物。 对于组织样品： 1.手术切除的组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，洗净组织血迹，用滤纸吸干组 织表面液体，将组织称量后切成几个较小的组织块放入匀浆器中。 2.取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入 PMSF,使 PMSF 的最终浓度为 1x。 3.按组织净重（g）：裂解液(ml)=1：10 的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆(如果裂解 不充分可以适当添加更多的裂解液, 如果需要高浓度的蛋白样品, 可以适当减少裂解液的 用量) 。 4.匀浆器匀浆,冰上孵育 20min，直至充分裂解。 5.充分裂解后, 14000g 离心 10 分钟,取上清,即为蛋白提,蛋白浓度的测定,使用BCA法测，详细步骤参考说明书: (1) 取 1.2ml 蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（30mg BSA）中，充分溶解后配制成 25mg/ml 的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可-20长期保存； (2) 稀释标准品：取适量 25mg/ml 蛋白标准，稀释至 0.5mg/ml(蛋白样品在什么溶液中，标 准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用 0.9%NaCl 或 PBS 稀释标准品)。 稀释后的 0.5mg/ml 蛋白标准也可-20长期保存； (3) 配制 BCA 工作液：按 50 体积试剂 A 加 1 体积试剂 B 配制适量工作液，充分混匀（配 制的量视样本量而定，200l/孔）。工作液室温 24 小时内稳定。 (4) 加标准品：将标准品按 0、1、2、4、8、12、16、20l 加入 96 孔板的标准品孔中（做 副孔），加标准品稀释液补足到 20l。,(5) 加样品：加 2l 样品到 96 孔板的样品孔中，加 18l PBS(好用 1%SDS 或裂解液，保 持与原样本中的一致)，使总体积达到 20l。 (6) 加工作液：每孔加入 200l 步骤 2 所配制工作液。 (7) 37静置 20-30 分钟。可室温放置 2 小时。 (8) 酶标仪测定 A562，540-595nm 之间的波长也可接受。 (9) EXCEL 绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。 附,SDSPAGE 电泳,不连续的电泳缓冲体系。 SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。,【SDS-PAGE基本原理】,SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关,SDS：,阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。,蛋白质-SDS胶束的特点：,（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒 （2）平均1g 蛋白质结合1.4g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的 （4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比,SDS-PAGE凝胶的有效分离范围,SDSPAGE 电泳详细过程,（1） 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干 （2） 灌胶与上样 1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要 使两玻璃对齐，以免漏胶。） 2、 根据蛋白大小配制一定浓度的分离胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时， 可用 1ml 枪吸取 5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。 然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面 快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才 不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。） 3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min 使胶充分凝固 就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。,灌制分离胶 隔绝空气,ddH2O 0.1%SDS:8%,4、 按前面方法配 5的浓缩胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空 间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以 免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收 缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经 常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻 轻将其拔出。 5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向 外。） 6、 测完蛋白含量后，计算含 50g 蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样 品至 PCR管中，加入 5SDS 上样缓冲液至终浓度为 1。（5SDS 上样缓冲液事先跟巯基乙醇按1ml加50ul配好。）上样前要将样 品于沸水中煮 5min 使蛋白变性,灌制积层胶 插入梳子,7、 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。） 用微量移液枪贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将移液枪的枪头插 至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也 可能使样品溢出），没加一个样品要换一次枪头 （3） 电泳 电泳时间一般 1.5h，电压为 浓缩胶80V 较好，分离胶120V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止 电泳，进行转膜。,转膜,（1） 转一张膜需准备 6 张 5x9cm的滤纸和 1 张 4x8cm的PVDF膜。切 滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的膜 置于甲醇中浸 15秒才可使用。 （2） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和 浸过的膜。 （3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以 擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫 三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去 其中的气泡。,（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。 撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。） 除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。 小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。 将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖 3 张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作 在转移液中进行，要不断的擀去气泡。,（5） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电 转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用 恒流300mA,转2h （6） 转完后将膜用 1丽春红染液染 5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染 上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。(此步可以省略),免疫反应,（1） 将膜用 TBST从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇 动封闭 1h。 （2） 将一抗用 TBST 稀释至适当浓度（在 1.5ml 离心管中）。剪一大小合适的杂交袋，取出膜，在滤纸上沾几下（PVDF 膜需保持湿的状态）， 放入杂交袋中，加入一抗后，用封口机封闭在袋内，赶尽气泡，4 过夜（指 12 小时）。 或者室温摇床1.5h. 取出滤膜用 TBST 漂洗 3 次，每次 10min（室温，平缓摇动）。 （3） 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育 1.5h 后，用 TBST 在室温 下脱色摇床上洗三次，每次 10min；,化学发光，显影，定影,（1） 将 A 和 B 两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min 后，将膜蛋白面朝下与此混 合液充分接触；1min 后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入 X光片夹中,（2） 在暗室中，将 1显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出 X光片， 用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大 1cm）；打开 X-光片夹，把 X 光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上 X-光片夹，开始计时；根据信号 的强弱适当调整曝光时间，一般为 1min 或 5min，也可选择不同时间多次压片， 以达最佳效果；曝光完成后，打开 X-光片夹，取出 X-光片，迅速浸入显影液中 显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为 12min（2025 ），温度过低时（低于 16）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把 X光片浸入定影液中，定影时间一般为 510min，以胶片透明为止；用自来水冲 去残留的定影液后，室温下晾干。 应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对 结果产生影响。全程不要用镊子去夹。,凝胶图象分析,将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统对目的条带进行光密度定量。计算出相对表达量，然后作条形图。,常见的一些问题与分析,1.暗处观察膜，明明发现只有一条荧光带，为何我显影出来的条带却很多，形成了拖尾现象？ 答：主要是将胶片放到膜上后，还在拖动它，取出胶片的时候，要小心，尽量不要拖动胶片，可以将整个压片盒倒转过来打开。 2.为何每次洗出来的条带都是很粗，每个样品之间的间隔很小呢？ 答：这是一个常见的问题，有些人的做法是减少上样量，但最后还是出现了同样的问题。其实关键在于显影的技巧，当胶片在显影液中，刚出现条带时，叫要立刻拿上来了，然后条带会慢慢变粗，当达到想要的效果时，立刻放到定影液中定影。,3.胶带显影出来后，出现了几条条带，我怎么知道哪个是我们的目的条带，还有哪个样品是多少号怎么看？ 答：显影完后，晾干，拿去跟膜进行对照，根据mark的大小标出相应条带的大小，这里关键在于，压片的时候，放胶片一定要按正确的方式放，一般胶片半圆角的两边要跟压片盒的左上角的两边紧挨着对齐。用梳子去跟膜和胶片匹对就可以找出每个加样孔的位置了。 4.为什么我转膜后，没有看到膜上有marker? 答：很有可能是你转膜的时，方向搞错了，黑胶白膜，夹子黑的一面要跟电泳槽黑的一面对齐，白的一面跟电泳槽红的一面对齐。,5. SDS-PAGE 电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到 电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择 pH6.7，分离胶选择 pH8.9，选择 trisHCL 系统，TEMED 与 AP：AP 提供自由基，TEMED 是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫 酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取 消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。,