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第40讲 生物技术在其他方面的应用,第十一单元 生物技术实践,考纲考频 1DNA的粗提取与鉴定(3年3考) 2.PCR技术的基本操作和应用(3年4考) 3.蛋白质的提取和分离(3年2考) 4从生物组织中提取某些特定的成分(3年5考),第十一单元 生物技术实践,一、DNA的粗提取与鉴定 1原理：利用DNA与RNA、蛋白质等在_性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 2实验设计 (1)材料的选取：选用_相对较高的生物组织。,物理和化学,DNA含量,蒸馏水,滤液,NaCl,蛋白质,蛋白质,(4)DNA的析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、_溶液可使DNA析出。 (5)DNA的鉴定：将析出的DNA溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂,沸水浴加热，溶液变蓝。 二、多聚酶链式反应扩增DNA片段 1PCR原理 在80100 的温度范围内，DNA发生_，双螺旋结构解体，在温度缓慢降低后，DNA发生_，DNA单链与_通过碱基互补配对结合，耐高温的DNA聚合酶从_开始延伸DNA链。,冷却的酒精,变性,复性,引物,引物的3端,2PCR的条件 缓冲溶液、DNA模板、2种_、4种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时要控制温度。 三、血红蛋白的提取和分离实验 1常用的分离方法：_法、凝胶电泳法等。 2基本原理 (1)凝胶色谱法的原理：相对分子质量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程_，流动_；相对分子质量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程_，流动_。,引物,凝胶色谱,短,快,长,慢,(2)凝胶电泳法的原理：不同蛋白质的带电性质、_、形状和_不同，在电场中受到的作用力大小、_、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动_和运动_不同。 3血红蛋白的提取和分离程序 (1)样品处理 红细胞的洗涤_的释放分离血红蛋白溶液。 (2)粗分离_：除去样品中相对分子质量较_的杂质。 (3)纯化:一般采用_法对血红蛋白进行分离和纯化。 (4)纯度鉴定：一般用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定蛋白质的相对分子质量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。,电量,大小,方向,血红蛋白,速率,透析,方向,小,凝胶色谱,四、植物有效成分的提取 1植物芳香油的提取 (1)植物芳香油的主要化学成分：萜类化 合物及其衍生物，具有很强的_性。提取方法有蒸馏、_和萃取等。,挥发,压榨,水蒸气蒸馏法,NaCl,无水Na2SO4,过滤,压榨,压榨,过滤,水,萃取,纸层析法,石油醚,1(2014高考江苏卷)下列关于“DNA的粗提取与鉴定” 实验叙述，错误的是( ) A酵母和菜花均可作为提取DNA的材料 BDNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水 C向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物 DDNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝,C,解析：酵母菌和菜花细胞的细胞核都含有DNA，可作为提 取DNA的材料；DNA能溶解在不同浓度的NaCl溶液中，且溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，在利用渗透作用原理向生物材料中加入蒸馏水时，一方面促使细胞吸水涨破，另一 方面释放出的DNA也就溶解在蒸馏水中；向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，目的是加快 细胞吸水 涨 破，释放其 中的DNA，而DNA则溶解在蒸馏水中，因此玻棒上不可能有白色絮状物；DNA溶液与二苯胺试剂经沸水浴加热会变蓝。,2标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是( ) A94 、55 、72 B72 、55 、94 C55 、94 、72 D80 、55 、72 解析：当温度上升到90 以上(9096 )时，双链DNA解旋为单链，称之为变性；当温度下降到50 (4060 )左右 时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72 (7075 )时，溶液中的四种脱氧核苷酸在 Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。,A,3下列有关“血红蛋白提取和分离”的叙述中,正确的是( ) A用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是涨破红细胞 B将血红蛋白溶液进行 透析，其目的是去除相对分子质量较大的杂质 C血红蛋白释放时加入有机溶 剂，其目的是使血红蛋白溶于有机溶剂 D整个过程不断用磷酸缓冲液 处理，是为了维持血红蛋白的结构和活性 解析：A项应用生理盐水洗涤，目的是去除杂 蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。B项中的血红蛋白为大分 子，透析的目的是为了除去小分子物质。C项中血红蛋白释放时 加入有机溶剂，其目的是溶解磷脂，加速血红蛋白的释放。,D,4在玫瑰精油的提取和胡萝卜素的提取过程中共有的操作是( ) A纸层析 B水浴加热 C过滤 D加入NaCl 解析：纸层析法用于胡萝卜素的鉴定；水浴 加热用于胡萝卜素的萃取；在玫瑰精油的提取和胡萝卜素的提 取过程中都要用到过滤；在玫瑰精油的提取中加入NaCl使油水分层。,C,考点一 DNA和蛋白质的提取,考点二 PCR技术的基本操作和应用,考点三 植物有效成分的提取,1DNA的粗提取 (1)DNA与蛋白质在不同NaCl溶液中溶解度不同,考点一 DNA和蛋白质的提取,析出,溶解,增大,(2)DNA的析出与鉴定 析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液等体积的冷却的_溶液(体积分数为95%)，静置23 min，溶液中会出现白色丝状物(此即粗提取的DNA)，用玻璃棒沿_卷起丝状物。,酒精,一个方向搅拌,鉴定,二苯胺试剂,变蓝,不变蓝,2.蛋白质的提取和分离(以血红蛋白为例) (1)常用的蛋白质分离方法 凝胶色谱法：,扩散运动,电泳法原理： a在一定pH下，一些生物大分子(如多肽、核酸等)可解离的基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些 带电分子会向着与其所带_的电极移动。 b由于分离样品中各种分子带电性质的差异以及_，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。,电荷相反,分子本身的大小、形状不同,红细胞的洗涤,释放血红蛋白,凝胶色谱法进行分离和纯化,相对分子质量,深度思考 1粗提取DNA时不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料的原因是什么？ _ 2DNA粗提取实验中两次使用蒸馏水，其目的分别是什么？ _ 3在血红蛋白的提取过程中，哪些过程能影响血红蛋白提取纯度？ _ 4如何检测血红蛋白的分离是否成功？ _,提示：1.哺乳动物成熟红细胞无细胞核。 2第一次的目的是使成熟的鸡血细胞涨破放出DNA，第二次的目的是稀释NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。 3红细胞的洗涤次数少，不能除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长，会使白细胞一同沉淀，得不到纯净的红细胞。 4看血红蛋白的红色区带是否均匀、平整地随着洗涤液缓慢流出。,1(2015南京市质检)某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动，具体步骤如下： 材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20 、另一组置于20 条件下保存24 h。 DNA粗提取： 第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。 第二步：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。,第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol/L NaCl溶液溶解上述絮状物。 DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如表。 (注：“”越多表示蓝色越深),分析上述实验过程，回答下列问题： (1)该探究性实验课题名称是_。 (2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少_。,探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响,DNA断裂,(3)根据实验结果，得出结论并分析。 结论1：与20 相比，相同实验材料在20 条件下保存，DNA的提取量较多。 结论2：_ _。 针对结论1，请提出合理的解释：_。,等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多,低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢,(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA 纯度， 依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是：_ _， 然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。,将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液,解析：(1)该实验中把不同的材料在不同条件(温度)下处理， 目的是探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。 (2)“缓缓地”搅拌是为了减少DNA断裂。(3)分析表格可得 出结论：相同材料在20 条件下保存，DNA的提取量 较多。原因可能是低温抑制了DNA酶的活性，DNA降解速 度慢。等质量的不同实验材料，在相同保存温度下，从蒜 黄中提取的DNA最多。(4)依据氯仿的特性，可在第三步得 到的溶液中加入氯仿，使蛋白质变性。,1PCR相关技术原理与条件 (1)PCR：多聚酶链式反应的简称，是一种体外迅速扩增_的技术。 (2)引物：是一小段RNA或单链DNA，它能与_的一段碱基序列互补配对。 (3)扩增方向：DNA的合成方向总是从子链的_延伸。,考点二 PCR技术的基本操作和应用,DNA片段,DNA母链,5端向3端,DNA的热变性,不会失活,两种引物,2PCR的反应过程,双链DNA解旋为单链,碱基互补配对,5端向3端,3.结果：上述三步反应完成 后，一个 DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以_的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。 4细胞内DNA复制与PCR技术比较,2n,解旋,TaqDNA聚合酶,高温,模板,四种脱氧核苷酸,深度思考 下图为利用PCR技术扩增目的基因的过程，图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。,(1)从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为多少？ _ (2)在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？ _ 提示：(1)15/16。(2)第三轮。,2(2015河北冀州中学高三仿真)在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：,(1)在相应的横线上写出引物，并在复性这一步骤中将引物置于合适的位置。 (2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。 (3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点：_，循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为_。,每个DNA分子各有一条链含32P,答案：(1)5GAOH HOAG5 5GGTC3 (2)3CCAG5 5GGTC3 5GGTC3 3CCAG5,1/2n,(4)PCR反应过程的前提条件是_，PCR技术利用DNA的_原理解决了这个问题。 (5)在对样品DNA进行分析的过程中发现，DNA掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是_。,DNA解旋,热变性,蛋白酶,解析：(1)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端 延伸DNA链，所以引物就提供了3端，子链延伸方向为53，引物与b链部分碱基互补，引物则与a链部分 碱基互补，且连接到a链的3端，故引物 的 结 构为5GAOH。(2)经过一次循环后，产生的 两个DNA分子分别含有引物和引物。(3)由于作为原料的四种脱 氧核苷 酸被32P标记，所以新合成的子链均含有 放射性，一次循环后的 两个DNA各有一条链含 32P，若复 制n次，共产生子链2n2条；其中只有2条 DNA母 链不含32P，则其所 占比例为2/(2n2)1/2n。,(4)DNA复制是以两条母链为模板，按照碱基互补配对原则进行的。因此，首先要解旋，使两条母链碱基暴露出来，才能按照碱基互补配对的原则把相应的核苷酸一个个地连接起 来。DNA分子在80 100 的温度范围内变性，双链解开成单链，当温度慢慢降低时，又能重新结合形成双链。(5)本题考查了DNA中杂质蛋白质的去除，利用酶的专一性，应加入蛋白酶。,考点三 植物有效成分的提取,水蒸气,油水混合物,水蒸气蒸馏,除水,高考警示 (1)加入NaCl的目的是增大盐水的浓度，有利于玫瑰精油与水的分层； (2)加入无水Na2SO4的目的是吸收精油中残留的水分。 2橘皮精油的提取 (1)实验原理： 橘皮精油的有效成分是柠檬烯，其在用水蒸气蒸馏时会发生部分水解，同时使用水中蒸馏法又会产生原料焦糊的问题，故一般采用_。 (2)实验流程： 石灰水浸泡漂洗_过滤静置 _橘皮油,压榨法,压榨,再次过滤,3胡萝卜素的提取 (1)实验原理： 根据胡萝卜素易溶于有机溶剂的特点，可用_的方法提取，即将提取物溶解在有机溶剂中，将有机溶剂蒸发后得到提取物。 (2)实验流程： 胡萝卜粉碎干燥_过滤_胡萝卜素,有机溶剂萃取,萃取,浓缩,深度思考 1.蒸馏时收集的蒸馏液是否是纯的玫瑰精油？ _ 2怎样保存密封不严的瓶装玫瑰精油？ _ 3萃取过程为何避免明火加热，采取水浴加热？ _ 4如图是某同学设计的纸层析法鉴定胡萝 卜素粗品的实验装置图，该装置一个明显 的错误是什么？ _,提示：1.不是。玫瑰精油将和水蒸气一同蒸馏出来，故不是纯的玫瑰精油。 2玫瑰精油易挥发，应保存在温度较低的地方。 3这是因为有机溶剂都是易燃物，直接用明火加热容易引起燃烧、爆炸。 4没有盖玻璃盖，将导致溶剂大量挥发。,3(2015河北衡水中学月考)请分析回答橘皮精油提取过程的有关问题： (1)提取橘皮精油，常采用_法而不用蒸馏法，原因是水中蒸馏会导致_。 (2)为了提高出油率，首先将橘皮_，并用石灰水浸泡，石灰水的作用是_。 (3)压榨过程中为了使橘皮油易于与水分离，常加入相当于橘皮质量一定百分比的_，并调节pH至_。,压榨,原料焦糊或有效成分水解等问题,干燥去水,破坏细胞结构，分解果胶，防止橘皮压榨时滑脱,NaHCO3和Na2SO4,78,(4)将压榨液过滤除去固体物和残渣后，用_法进一步除去质量较小的残留固体物，并分离出上层的橘皮油。将分离出的橘皮油在510 下静置57天，使_，用吸管吸出上层澄清橘皮油，其余部分再次过滤。,离心,杂质沉淀,解析：(1)植物芳香油的提取方法有蒸馏、压榨和萃取等。由 于水中蒸馏会导致原料焦糊或有效成分水解等问题，所以提 取橘皮精油，常采用压榨法而不用蒸馏法。(2)为了提高出油 率，首先将橘皮干燥去水，并用石灰水浸泡，石灰水浸泡的 目的是破坏细胞结构，分解果胶，防止橘皮压榨时滑脱。(3) 压榨过程还要分别加入相当于橘皮质量一定百分比的 NaHCO3和Na2SO4，并调节pH至78,目的是使橘皮油易于 与水分离。(4)将压榨液过滤除去固体物和残渣后，用离心法 进一步除去质量较小的残留固体物，并分离出上层的橘皮 油。将分离出的橘皮油在510 下静置57天，使杂质沉 淀，用吸管吸出上层澄清橘皮油，其余部分再次过滤。,易错点1 DNA粗提取与血红蛋白提取易于混淆,点拨,易错点2 纸层析操作时的易错点 点拨 (1)层析时注意选择干净的滤纸，为了防止操作时对滤纸的污染，应尽量避免用手直接接触滤纸，可以戴手套进行操作。 (2)点样时应注意点样斑点不能太大(直径应小于0.5 cm)，如果用吹风机吹干，温度不宜过高，否则斑点会变黄。 (3)将点好样的滤纸卷成筒状，卷纸时注意滤纸两边不能相互接触，以免因毛细管现象导致溶剂沿滤纸两边的移动加快，溶剂前沿不齐，影响结果。 (4)层析液不可没及样品原点，以免色素溶解于层析液中，使鉴定失败。 (5)层析是否提取到胡萝卜素，通过与标准样品中的胡萝卜素作对比予以确认。,1(2015哈工大附中月考)将丝状物溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。( ) 2(2013江苏卷T4A)进行DNA粗提取和鉴定实验时，加入洗涤剂后用力进行快速、充分的研磨。( ) 3(2015石家庄市联考)洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂。( ) 4在PCR技术中延伸的温度必须大于复性温度，而小于变性温度。( ),5血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测。 ( ) 6(2012江苏卷T18A)洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在 NaCl溶液中的溶解度。 ( ) 7(2013北京卷T5D)PCR呈指数扩增DNA片段是因为上一轮反应的产物可作为下一轮反应的模板。( ) 8蒸馏法的实验原理是利用水将芳香油溶解下来，再把水蒸发掉，剩余的就是芳香油。 ( ),
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