基因工程期末考试重点知识整理.doc

基因工程第一章 基因工程概述1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT)基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术.2、基因工程的历史基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化基因工程发展阶段的几个重要事件：一系列新的基因工程操作技术的出现；各种表达克隆载体的成功构建；一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现3、基因工程的内容（P9）4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)第二章 分子克隆工具酶5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答)概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内特点（参加PPT）命名： 依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，表示序号。分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：型酶、型（s型）酶和型酶。真核细胞中有4中DNA聚合酶：，线粒体DNA聚合酶原核生物中3中DNA聚合酶：，6、几个基本概念粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为。平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为。同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如： BamHI和BstI均可识别GGATCC。同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如： TaqI：TCGA；ClaI：ATCGAT；AccI：GTCGAC星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。DNA物理图谱：（多为质粒图谱）7、大肠杆菌中甲基化酶的种类Dam甲基化酶，在序列GATC中A的N6位置引入甲基。Dcm甲基化酶 ，dcm基因表达胞嘧啶甲基化酶，它能特异性识别DNA双链上的CCA(T)GG序列，并使第二个C5甲基化，即CmCWGG，避免DNA受到相关限制酶的切断。dcm基因的变异导致胞嘧啶甲基化酶活性缺失，使外源DNA上的C不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。EcoKI甲基化酶；SssI甲基化酶8、依赖于甲基化的限制系统（McrA,McrBC,Mrr）依赖于甲基化的内切酶E.coli中至少有3种依赖于甲基化的限制系统mcrA基因表达E.coli防御体系中起重要作用的McrA酶，该酶能特异性地作用于外来DNA上的被甲基化的胞嘧啶序列，即C5mCGG特异序列，使之分解，对大肠杆菌本身起保护作用。mcrA基因的变异，导致上述功能缺失，对外来DNA中被甲基化的胞嘧啶特异序列（C5mCGG）失去作用，有利于限制酶及甲基化酶的克隆体的稳定。mcrB, C基因表达McrB和McrC两种特异性蛋白，它们在E.coli的防御系统中起重要作用。一般情况下，只有这两种蛋白同时存在时才表现出活性，McrC具有识别和调节功能，它能特异性的结合到外源DNA被甲基化的胞嘧啶的特异序列G5mC上，然后由McrB蛋白切断（McrB蛋白是特异性切断外来DNA中G5mC序列的限制性核酸内切酶)，防御外来DNA的侵入。mrr基因是大肠杆菌细胞防御系统中重要的基因之一，它能严格限制被甲基化的外源DNA的介入。另外，含有此基因型的菌株也可用于限制酶和甲基化酶的克隆体。9、几个基本概念DNA聚合酶，以单链DNA为复制模板，由5端开始复制到3端的酶。催化DNA的合成（具备模板、引物、dNTP等）及其相辅的活性。反转录酶，依赖于RNA的DNA聚合酶,有5-3合成DNA活性,无3-5外切核酸酶活性（RNaseH水解磷酸二酯键，剪断mRNA，cDNA第二条链合成）。来自AMV(禽成髓细胞瘤病毒)或M-MuLV(鼠白血病病毒)RNA聚合酶，识别DNA中启动子特异序列，合成RNA，无需引物。连接酶T4 DNA连接酶，反应底物: 黏端、切口、平末端的RNA(效率低)或DNA大肠杆菌DNA连接酶，活性与T4连接酶相似，但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的参与，与平末端连接效率很低，不连接RNA。Taq DNA连接酶，可连接dsDNA中的缺口间的两个寡核苷酸，需NAD+的参与，最适反应温度45-65。（VS TaqDNA聚合酶）T4 RNA连接酶，可使单链DNA或RNA之间相互连接，可用于标记RNA的3末端，单链DNA或RNA的连接、增强T4 DNA连接酶的连接活性以及合成寡核苷酸。T4多核苷酸激酶& 碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶可将ATP的-磷酸基团转移至DNA或RNA的5末端。主要用于对缺乏5磷酸DNA或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标记。（探针）碱性磷酸酶主要来源于牛小肠碱性磷酸酶（CIP或CIAP）能催化除去DNA或RNA5磷酸的反应，可防止DNA片段自连。第三章 分子克隆载体10、分子克隆载体必须具备的元件 在克隆载体DNA分子合适的位置应有1至多个克隆位点（MCS），供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子 克隆载体能携带外源DNA片段（基因）进入受体细胞，或停留在细胞质中能自我复制，或整合到DNA上随染色体DNA的复制而同步复制 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记基因 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞。11、表达载体必须具备的元件克隆载体必备元件+启动子，终止子，核糖体结合位点RBS书本p86-8712、标记基因的种类及作用原理选择标记基因：氨苄青霉素抗性基因（ampr）作用机理：Ampicillin可以抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性，即抑制细胞壁肽聚糖的合成。 ampr编码一种可分泌到细菌细胞周间质的酶，催化-内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。(目的菌落周围出现散点菌落，即次生菌落，通过提高氨苄青霉素的浓度和控制培养时间12h减少次生菌落)四环素抗性基因（tetr）作用机理：四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位过程。 tetr编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。氯霉素抗性基因（Cmr）作用机理：氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质的合成。常用的cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，即一个四聚体细胞质蛋白，在乙酰辅酶A存在时，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。卡那霉素（新霉素）抗性基因作用机理：卡那霉素和新霉素是氨基糖苷类抗生素，都可与核糖体结合并抑制蛋白质的合成。该基因（kanr/neor）是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶的基因，该酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。琥珀突变抑制基因supF 琥珀突变（书本p41）筛选标记基因： -互补（蓝白斑筛选）：现在使用的许多载体都带有一个E.coli DNA的短区段，其中含有-半乳糖苷酶的-肽基因（lacZ）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。这个编码区中插入了一个MCS，它并不破坏读框，但是可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞，虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可融为一体，形成具有酶活性的蛋白，从而实现互补，这种现象称为。插入失活，某段DNA序列的插入，使得被插入的基因功能丧失功能，从而达到筛选的目的。蓝白斑筛选：在lacZ编码区上游插入一小段DNA片段，不影响-半乳糖苷酶的功能互补。但是，若在该DNA小片段中再插入一个片段，将不可避免的产生无互补能力的-半乳糖苷酶片段13、DNA的特点DNA在噬菌体中是线状，全长48502bp，左右各有12个核苷酸组成的5凸出粘性末端（cohesive end），且两者互补。进入宿主细胞后，粘性末端连接成为环状DNA分子，这样能连接的末端称为cos位点。14、载体的选择标记lacZ基因，在填充片段中带有-半乳糖苷酶基因片段cI基因失活cI基因：全面抑制并阻断裂解生长必须基因的表达，促进-噬菌体进入溶原状态。外源基因插入cI基因中，使E.coli进入裂解生长状态。Spi筛选野生型噬菌体在带有P2原噬菌体的溶原性E.coli中的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感。Spi+ :噬菌体不能感染E.coli（P2）Spi- :(red- gam-）噬菌体能感染E.coli（P2） 形成小噬斑宿主：recA+ ；chi位点第四章 人工染色体载体15、人工染色体的种类和必备元件（概念PPT，结构，组成，筛选）酵母人工染色体载体YAC、细菌人工染色体载体、P1载体和PAC载体YAC（yeast artificial chromosome）克隆载体是最早构建成功的人工染色体克隆载体，能像染色体一样在酵母细胞中正常的复制。它是以pBR322为骨架建立，带有pBR322的复制起点ori和筛选标记基因Ampr，另外还加入作为酵母chr.所必须的一些成分：一段控制酵母chr.复制的自主复制序列（ARS）；一段来自酵母chr.的着丝粒序列（能在细胞分裂过程中将chr.载体均匀的分配到子细胞中）；一对酵母的端粒序列（来自四膜虫chr.），防止chr.载体与其他chr.相互粘连，并避免在DNA复制过程中造成基因的缺失，从而保证了chr.载体在细胞分裂和遗传过程中的相对独立和稳定；选择标记TRP1和URA3（酵母Trp和U营养缺陷型的野生型等位基因）；克隆位点存在于酵母酪氨酸tRNA基因赭石突变的校正基因Sup4中。第五章 表达载体16、表达载体启动子的种类Plac 启动子（诱导型启动子）、Ptac 启动子（诱导型启动子）、T7启动子（T7噬菌体）和PL启动子（噬菌体）17、T7启动子的工作原理（参见PPT图文）第六章 基因操作中大分子的分离和分析18、质粒DNA的提取原理及步骤（实验）碱裂解法提取质粒DNA原理：根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH介于12.0-12.5这个狭窄范围内，线性DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭环质粒DNA的两条链仍保持在一起，因此复性迅速准确，而线性染色体DNA的两条链彼此已经完全分开，复性就不会那么迅速准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。书本p100-101碱裂解法小量抽提质粒(1)将细菌沉淀重悬于100l预冷的溶液I (50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris-HCl pH8.0,10mmol/L EDTA)中,剧烈震荡;(2)加200l新鲜配制的溶液II (0.2mol/L NaOH, 1%SDS), 缓和震荡,水浴5min;(3)加150l预冷溶液III (50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml)缓和震荡,冰浴5min;(4)4 以12000g离心5min,将上清转移到另一离心管中(5)向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1），反复混匀，12000rpm离心5min，将上清转至另一离心管中;(6)向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置510min，12000rpm离心5min，弃上清，吸干离心管中的液体;（析出DNA）(7)用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清，自然干燥;（洗出金属盐离子）(8)加20l TE缓冲液，其中含有20g/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解(9)凝胶电泳检测抽提结果，剩下的DNA放-20C冰箱保存。19、凝胶电泳检测原理、种类、过程、注意事项凝胶电泳的原理：当一种分子被置于电场中，它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身携带的净电荷成正比。在电场中，DNA带有负电荷，向正极泳动。在一定的电场中，DNA分子的泳动速度取决于核酸分子本身的大小和构型。种类：琼脂糖凝胶电泳（凝胶浓度越大，孔隙越小，越适合小分子，DNA结构，DNA分子量 , V共价闭环V线状V开环状）、 聚丙烯酰胺凝胶电泳、 脉冲场凝胶电泳20、SDS-PAGE原理、各成分作用原理：SDS-PAGE(分离蛋白质和寡核苷酸)，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂(巯基乙醇、二硫苏糖醇)能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。各成分作用，聚丙烯酰胺：丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择trisHCl系统；TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基磺酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。21、PAGE与琼脂糖凝胶电泳的区别（书本p102-103）检测大小（PAGE分辨率更高）支架（琼脂糖，丙烯酰胺聚合（隔绝空气-垂直结构，加促凝剂）垂直与水平结构百度完善.22、分子杂交种类、原理、过程Southern 杂交；Southern 印迹杂交由E. Southern于1977年建立。它根据毛细管作用原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA 探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段。过程：1、酶切；2、电泳/照相；3、变性/中和 变性试剂：0.4M NaOH 中和试剂：0.5M NaOH /1.5M NaCl 或1M Tris （pH7.4）/1.5M NaCl；4、转移 转移方式：毛细管 电转移 真空 转移buffer：6SSC（或SSPE）；5、固定 80 2hr，或者UV照射，microwaveNorthern杂交；主要针对RNA分子的检测，基本步骤与Southern印迹杂交相似，变性试剂不同等，见作业百度。Western杂交；转移的是蛋白质而不是RNA菌落杂交（菌落原位杂交）：其他分子杂交p109噬菌斑杂交：书本p109斑点杂交（斑点印迹杂交）：将通过特殊的加样装置将变性的DNA或RNA核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异性DNA或RNA。狭线杂交：23、探针种类同源或部分同源探针、总cDNA探针、特异性cDNA探针、人工合成的寡核苷酸探针24、E.coli 感受态细胞制备过程PPT25、DNA导入大肠杆菌的方法影响转化的因素：DNA分子导入大肠杆菌主要通过转化来完成，噬菌体和M13噬菌体感染宿主细胞时分别涉及转导和转染过程转导，感受态细胞，CaCL2转化法，电转化法转染:采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，将重组噬菌体DNA分子导入受体细胞的过程。转导:通过噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。26、重组DNA分子导入真核细胞的方法电穿孔法、基因枪法、 显微注射法、脂质体介导法、 花粉管通道法，农杆菌介导27、重组子的筛选方法（一）遗传表型直接筛选法1）、根据载体选择标记初步筛选转化子抗药性筛选； 插入失活筛选法； 插入表达筛选法； 显色互补筛选法2）、营养缺陷型检测法根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质，筛选含目的基因的克隆子。若目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现出抗性标记或基因产物与某些药物作用是颜色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的克隆子。该方法的使用前提是待选择的目的基因能在受体菌中进行表达。3）、形成噬菌斑筛选法 DNA载体被外源DNA分子插入后，重组 DNA分子大小必须在野生型 DNA长度的75105%范围内，才能在体外包装成具有感染活性的噬菌体颗粒。转导受体菌后，转化子在培养基平板上被裂解形成噬菌斑，而非转化子正常生长。噬菌斑中的噬菌体即为重组子。（二）依赖重组子结构特征分析的筛选法1）、快速裂解菌落鉴定分子大小（质粒快检）此法主要是根据有外源DNA片段插入的重组质粒与载体DNA之间大小 差异来区分重组子和非重组子。2）、限制性核酸内切酶酶解分析法 通过快速裂解菌落鉴定分子大小的方法虽可初步筛选到重组子菌落，但却难以将其中的期望重组子和非期望重组子区分开，因为重组质粒DNA中，质粒载体可能会与一个以上的外源DNA片段连接重组，而采用限制性核酸内切酶分析法不仅可进一步筛选鉴定重组子，而且能判断外源DNA的插入方向及分子质量大小等。3）、利用PCR方法筛选重组子 载体DNA分子中，外源DNA插入位点的两侧序列多为固定已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，以从初选出来的阳性克隆中提取的少量质粒DNA为模板进行PCR反应，通过对PCR产物的电泳分析就能确定是否是重组子菌落。28、RNAi的概念和作用机制（RNA干扰）RNAi（RNA interference ）是由双链RNA分子在mRNA水平阻断相应基因表达或使其沉默的过程。它广泛存在于生物界，是生物体抵御病毒或其它外来核酸入侵而保持自身遗传稳定的保护性机制。目前在果蝇、真菌、昆虫、植物以及哺乳动物中均有发现。RNAi作用机制：长链dsRNA被切割成20-25nt长度的片段，即siRNA。siRNA与核酸诱导的沉默复合物（RISC）结合，作为模板识别目的mRNA。通过碱基互补配对原则，mRNA与siRNA中的反义链结合，置换出正义链。双链mRNA被相关酶切割产生22nt左右的siRNA，后者与RISC结合，继续反复切割mRNA，从而使基因沉默。29、miRNA的概念和作用机制 Small RNAs主要包括两大类： miRNAs (microRNAs) siRNAs (short interfering RNAs)miRNAs普遍存在于动植物体内，影响基因表达、细胞周期调控和个体发育，它由非编码基因转录物形成的茎环结构加工而来，长度22nt左右；成熟miRNA的5端为磷酸基团，3端为羟基；表达具有严格的时序性和组织特异性；无ORF，多存于间隔区，进化中结构高度保守。第八章 PCR技术及应用30、PCR的概念、基本要素、具体步骤、反应体系PCR（polymerase chain reaction）：聚合酶链式反应，是指通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术，它包括变性、退火、延伸三个步骤。基本要素：引物、 dNTP、 耐热DNA聚合酶、模板DNA具体步骤：变性（denaturation）：9098；退火（annealing）：37 72 ；延伸（extension）：72 。PCR反应体系脱氧核苷三磷酸（dNTP），dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP是PCR的原材料，通过PCR过程聚合成互补链DNA。贮存浓度：2.5mM，使用浓度：200M。使用浓度不当会影响扩增的产量、特异性和保真度。缓冲液（buffer）：TAE，TBE，TPE（T-Tris，E-EDTA，A-乙酸，B-硼酸，P-磷酸）PCR标准缓冲液含10mmol/L Tris*HCL，PH8.3-9.0。作用：缓冲PH，提供部分反映成分。引物（primer），最佳引物使用浓度为0.1 M 1.0 M 之间。引物浓度太低，扩增产物太少；引物浓度太高，易出现非特异性扩增反应。引物长度20nt时：Tm=4（G+C）+2（A+T）引物设计要求:p 设计的引物的核苷酸序列必须与模板链3端的一段核苷酸序列互补,且3端必须有游离的-OH基团；(从3端开始接合模板链,PPT上思考题选A，D)p 引物一般由2030个核苷酸组成，4种核苷酸尽可能随机分布，GC含量应达4060%；p 引物中应尽量避免回纹序列出现；p 引物中最好含有进一步操作中可利用的限制性核酸内切酶识别序列。模板DNA，作为PCR 的靶DNA一般是一个待扩增的特定双链DNA片段，应知道其两端2030bp的核苷酸序列，供设计一对引物之用。PCR的模板是一条单链DNA片段，其3端具有与引物杂交的序列。 耐高温DNA聚合酶31、耐高温DNA聚合酶的种类、各自的特点Taq DNA聚合酶，来自嗜热古细菌Thermus aquaticus。该菌1967年从温泉中分离，最适生长温度70。现市场上销售的是该基因在E.coli细胞中的表达产物。特征：相对分子质量为94103，为单分子酶，具较强的53DNA聚合酶活性和较弱的53外切酶活性，缺乏3 5外切酶活性。最适pH9.0，最适反应温度75。合成出错几率8.910-51.110-4。Pwo DNA聚合酶来自喜温性古细菌Pyrococcus woesei。现市场上销售的是该基因在E.coli细胞中的表达产物。特征：相对分子质量为90103，具较强的53DNA聚合酶活性，兼35外切酶活性。耐热性更高，保真度比TaqDNA聚合酶高10倍。Tth DNA聚合酶来自喜温性真细菌Thermus thermophilus HB8。具较强的53DNA聚合酶活性，缺乏3 5 外切酶活性。最适pH9.0，最适反应温度75。Mg2+存在时，以DNA为模板合成DNA，Mn2+存在时，可以RNA为模板合成cDNA，用于RT-PCR系统。 Vent DNA 聚合酶来自嗜热高温球菌Thermococcus litoralis 。相对分子质量85103。100时该酶半衰期为1.8hr，具有3 5 外切酶校对活性。合成的准确度比用Taq DNA 聚合酶高5 15倍。Pfu DNA 聚合酶来自激烈热球菌Pyrococcus fariosus。保真度较高。（35外切酶活性）目前错配率最低。KOD DNA 聚合酶特征：具有强力的35核酸外切酶活性，与Taq DNA聚合酶相比，保真度比后者高50倍左右。合成速度比Taq DNA聚合酶快2倍，比Pfu DNA聚合酶快6倍。耐热性比Taq DNA聚合酶好，在100、1小时的热处理后仍可保持约70的活性，故根据需要可以将热变性步骤的温度设定值提得更高，这对处理GC含量高的模板等具有特异性高级结构的样品非常有利。高保真 DNA 聚合酶Phusion 高保真DNA聚合酶 (Finnzymes )，Phusion采用一种新的蛋白融合技术，与一种独特的双链DNA结合蛋白融合后，可以和模板更加紧密的结合，触发更为强劲和快速的扩增，它甚至可以用于结合那些最难被结合的模板, 持续扩增能力（processivity，决定最大扩增长度）是Pfu酶的10倍，Taq酶的2倍。 商用混合 DNA 聚合酶Ex Taq DNA聚合酶Ex Taq Hot start DNA聚合酶LA Taq DNA聚合酶LA Taq Hot start DNA聚合酶为了提高扩增的保真度或扩增较长DNA片段，将Taq DNA聚合酶的强启动能力和具有35外切酶活性高温DNA聚合酶的高持续活性和校正功能结合起来，可以达到很好的效果。32、PCR平台期的概念、出现平台期的原因平台期：出现平台期的原因可能有：后期循环酶浓度或聚合时间不足；引物耗尽；dNTP耗尽；产物浓度过高，以致dsDNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。33、PCR产物克隆的几种方式在PCR产物两端添加限制性酶切位点；A/T克隆法；平末端DNA片段的克隆；长片段DNA的PCR扩增34、PCR扩增未知片段的几种方式反向PCR；利用接头的PCR；热不对称交错PCR35、RACE、DD-PCR、RAPD、AFLP的概念、原理（参见PPT）第九章 DNA序列分析36、两种不同的测序方法的基本原理Maxam-Gilbert 化学降解法将待测DNA片段的5端磷酸基团作放射性标记，再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并在该位置打断核酸链，从而产生一系列5端被标记的长度不一且分别以不同碱基结尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样的方式用凝胶电泳进行分离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基序列。Sanger双脱氧链终止法双脱氧核苷酸（ddNTP）分子的脱氧核糖的3位置的羟基缺失，当它与正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在DNA聚合酶的作用下，虽然它也能参与DNA合成，但由于其3位置的羟基缺失，使其下面的核苷酸的5磷酸基无法与之结合。也就是说，一旦双脱氧核苷酸整和到正在合成的DNA链中，该股DNA的合成就到此终止。37、序列分析的基本步骤1、模板制备和引物设计模板：单链或双链DNA，必须保证足够的浓度引物：18-22nt，55-60，尽量避免3个以上碱基重复， 尽量减少发夹结构形成的可能性。2、经典测序方法的反应步骤 模板变性 退火 标记掺入标记：-32PdATP、 -33PdATP、 -35PdATP 末端标记： -32PrATP 延伸 电泳分析和数据读取38、大片段DNA序列测定的方法通用引物指导未知序列的测定；引物步移；随机克隆测序；缺失克隆测序第十章 DNA诱变39、定向进化的概念对于某些实验目的，一次突变很难获得满意的结果，通常采用反复多次诱变和循环，其目的是获得满足人们需要的性能改良的蛋白质，又称为试管进化。40、随机诱变的方法、原理1）错误掺入突变，在体外DNA扩增中，使用具有错配倾向的DNA聚合酶以及反应条件，使碱基错误掺入到新合成的基因中，又称易错PCR（error-prone PCR）。热稳定TaqDNA聚合酶和突变DNA聚合酶error-prone PCR的实质：通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中突变的频率，降低聚合酶固有的突变序列倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的DNA群体，最后用合适的载体克隆突变基因。2）盒式诱变盒式取代诱变；简单的盒式取代诱变是通过限制性酶切除去特定的双链DNA片段，再与含有突变的单一序列双链寡核苷酸连接,得到取代突变，是一种定点诱变。混合寡核苷酸诱变；若用于取代的是含有随机突变的混合双链寡核苷酸，则可在限定区域内引入大量的随机突变。3）增变菌株的诱变作用概念：与DNA错配校正功能和DNA损伤修复有关的基因突变后，细胞内基因的突变频率大大增加，这样的菌株叫增变菌株（mutator strain）。常用增变菌株：E.coli XL1 - Red (mutD mutS mutT)mutD突变造成DNA聚合酶的35外切核酸酶活性缺陷，失去错配碱基的校正功能；mutS突变使DNA错配修复系统失去功能；mutT突变不能水解dGTP的氧化产物8-oxodGTP， 8-羟基鸟嘌呤在复制时掺入DNA中，造成突变。4）化学诱变用化学诱变剂处理双链DNA片段，将发生随机突变的片段群体克隆到合适的宿主中，构建成一个重组突变体库。用适当的功能分析可鉴别携带突变的重组子。41、体外重组的种类、概念、特点DNA洗牌法（DNA shuffling），是通过对一组序列相关DNA序列，经过超声波处理或在DNaseI的作用下随机切成小片段，然后在没有引物的情况下，采用有性PCR方法进行合成；随着循环数的增加，PCR产物将越来越接近切割前的目的基因的长度；最后用基因两侧的引物合成全长的基因。（筛选瓶颈）有性PCRDNA shuffling技术的优点：可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可达几十kb;通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高；从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片段上序列的信息，简化了操作程序；比随机突变显著提高了良性突变的概率。交错延伸重组交错延伸重组是一种简化的DNA shuffling技术。它不是由短片段组装全长基因，而是在PCR样反应中将含不同点突变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂（5sec）复性/延伸反应，在每一轮PCR循环中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复直到获得全长基因片段，重组的程度可通过调整反应时间和温度来控制。（控制温度，退火，延伸时间）随机引发重组RPR以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。该法可以用一条DNA单链为模板，因此可以直接以cDNA为模板进行随机引发重组。42、传统的定点诱变的方法、原理Kunkel定点诱变法（又称“U”法）（参见PPT）原理：dut-：dUTP酶（dUTPase）缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP，因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由T占据的位置。ung-：UDG酶缺陷，UDG酶尿嘧啶-N-糖基化酶可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基在体外用诱变引物合成的杂合双链DNA在导入正常ung+ dut+菌株后，只有带有突变位点的新合成链和作模板进一步复制，而野生型不能复制。这样能够生长的细胞就带有突变位点。（插入M13的DNA可以分别回收到两种形式：dsDNA和ssDNA）位点选择诱变（参见课本P179）位点选择诱变法使用了2个寡核苷酸引物，一个是用来引入突变的引物，另一个是用来选择用的。选择性引物可用来恢复有缺陷的抗生素抗性基因，同时可用来选择引入突变的DNA链。特点：可正向选择突变链，使用高保真的T4DNA聚合酶合成DNA，可以使用双良DNA作模板，可进行多轮筛选。但需特定载体，即含有一个有缺陷的抗生素抗性基因。转化子诱变（参见课本180）转化子诱变也使用了2个寡核苷酸引物，除了突变引物外，还使用了1个用来剔除单一酶切位点的引物。因此该方法也称酶切位点剔除法。将待突变的DNA片段装载到克隆载体上，该载体上必须存在1个单一酶切位点。当这两个引物同时指导DNA合成时，突变的DNA链将不再含有该单一酶切位点，而模板DNA在该位置能被切割。通过转化大肠杆菌，线性化的模板DNA不能复制，只有突变保持环状，可以获得转化子。43、PCR介导的定点诱变的方法、原理大引物PCR诱变；重叠延伸PCR诱变；重叠延伸剪接技术；同源重组法；双向PCR快速定点诱变44、PCR介导的定点诱变方法中，模板DNA的排除方法限制性内切酶 DpnI 可特异性切割dsDNA中的Gm6ATC位点，对半甲基化的DNA效率较低，完全不能切割非甲基化DNA。大肠杆菌体内DNA在Dam甲基化酶催化下完全甲基化，对DpnI 敏感。用4种通用dNTP在体外合成的DNA没有甲基化，可以抵抗DpnI的切割。第十章 DNA文库的构建和目的基因的筛选45、基因组DNA文库、cDNA文库的概念基因组DNA文库：将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。cDNA文库（针对真核生物）：若这些阳性菌落中所含的外源DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，则称之为cDNA文库。cDNA不含内含子。46、构建基因文库的基本程序提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA；重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；阳性重组菌落或噬菌斑的选择。47、鸟枪法的概念（质粒文库）鸟枪法（霰弹法）：利用机械剪切力和超声波等物理方法或限制性核酸内切酶酶切等生化方法将生物chr.打断，随后通过T4 DNA连接酶把这些片段与适当的质粒载体进行重组，转化受体菌后进行无性繁殖，获得一大群含不同外源DNA片段的克隆，再用简便的筛选方法从众多的转化菌株中筛选出含有某一目的基因的菌株，从中获得所要的基因。48、文库的代表性和随机性的意义代表性：指文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段 DNA 。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。完整的基因文库所需克隆的计算公式：PPT49、基因组DNA文库的构建流程及注意事项1）基因组 DNA 文库的载体制备 载体的制备要求：纯度高；去磷酸化好。2）高质量大分子量基因组 DNA 的提取和部分酶切 提取的基因组 DNA 要求保存完整。 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。3）文库的连接转化或包装侵染 在电转化和包装侵染过程中，首先选择转化效率高的感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白；同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。4）文库的质量检测 文库的平均插入片段长度是通过 PFGE 电泳检测一定数目的重组子的插入片段大小所得平均值。美国的研究机构对 BAC 文库，一般要求植物的在 130kb 左右，而动物的在 150kb 左右。插入效率：有插入片段的克隆在所有检测的克隆中所占的比例。基因组覆盖倍数平均插入片段长度克隆数/基因组 DNA 的长度（一般是约数 ）； 基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库。由于所使用的每个探针筛选的克隆数目即表明文库中对该基因位点的覆盖倍数，因此，基因组覆盖倍数又等于所有探针筛到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比值 50、cDNA文库的构建步骤细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；第一链 cDNA 合成；第二链 cDNA 合成；双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。双链cDNA文库非自然存在，病毒中逆转录成单链DNA。51、cDNA第一、第二链的合成方法第二条链：自身引导法；置换合成法；引导合成法；引物衔接头合成法52、文库中目的基因的筛选方法表型筛选法；杂交筛选（差别杂交 、mRNA 减法杂交、抑制性差减杂交）；免疫筛选；高表达基因 ；mRNA差别显示；酵母双杂交系统53、酵母双杂交的作用原理（参见PPT）酵母双杂交原理：利用融合蛋白的策略，将蛋白X与BD融合，蛋白Y与AD融合，将它们导入酵母细胞中共表达，如果X和Y相互作用，则会导致BD与AD在空间上接近，形成一个有功能的转录激活因子激活下游报告基因的表达。 一、名词解释: 56二、填空: 1 28三、问答: 6 5四、实验设计: 121.现已知某环境中有一种能产生淀粉酶的细菌，请设计一合理实验，获得该细菌中的淀粉酶基因序列并列出其在大肠杆菌中表达的实验步骤。2.试设计一合理实验，对克隆于载体pBR322 中的四环素抗性基因（TetR）内的特定位置碱基序列进行缺失突变，以获得预期的缺失突变体。一、概念：Sanger测序法；化解降解测序法； 基因组DNA文库；cDNA文库； PCR；A/T克隆；穿梭载体；人工染色体；蓝白斑筛选；.-互补；限制性内切酶；包涵体蛋白；RNAi；次生菌落；Kunkel定点诱变法；Northern杂交；PCR平台效应；RACE；噬菌体载体；表达载体；酵母双杂交系统1.目前实验室PCR常用的DNA聚合酶有哪些？列出各自的特点。2. 列出琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺电泳的异同点。3.请列出五种实验室常用的分子克隆工具酶，并分别说明各自的用途。4.描述大肠杆菌体内DNA复制与PCR过程的异同点。