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色谱分析法Chromatography,第一章色谱法引论,一、概述问题问题1：什么是色谱法？问题2：为什么色谱法能将混合物分开？问题3：色谱法的分类？问题4：各种色谱法的应用范围？,1、什么是色谱法？,茨维特的实验茨维特：俄国植物学家，主要从事植物色素的研究工作，在1906年发表的文章中，首次提出了色谱的概念。,茨维特的实验,碳酸钙,石油醚,什么是色谱法？,Chromatography色谱法是一种分离方法。特点：有两相，一是固定相（stationaryphase），一是流动相（mobilephase），两相作相向运动。将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。因此色谱分析是一种分离、分析法。,2、色谱法分离原理,当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用)。由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。,3、色谱法的分类,按流动相状态的不同，可分为以下三类：气相色谱法(GasChromatography,GC)液相色谱法(LiquidChromatography，LC)超临界流体色谱(SupercriticalFluidChromatography，SFC),色谱分析仪器流程,流动相携带进样装置引入的混合试样进入色谱柱混合试样在色谱柱中进行分离各组分依次进入检测器检测检测响应信号导入计算机得到色谱图,什么是气相色谱法？,以气体为流动相的色谱法GasChromatogaphy，简称GC按固定相状态的不同可分为：气固色谱(GSC)气液色谱(GLC),应用范围：用于分离分析易汽化（在-190-500范围内有0.2-10mmHg的蒸气压的）稳定、不易分解、不易反应的样品，特别适合用于同系物、同分异构体的分离。,什么是液相色谱法？,以液体为流动相的色谱法LiquidChromatography，简称LC应用范围：用于分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。,其他分类方式,按固定相使用的形式可分为柱色谱（columnchromatography）将固定相装在色谱柱内纸色谱（PaperChromatography）用滤纸做固定相或固定相载体的色谱薄层色谱（ThinLayChromatography）固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上,应用TLC:,123456789,BandsDescription1PseudoginsenosideF112AmericanGinseng3GinsenosideRg14GinsenosideRf5Ginseng6GinsenosideRc7GinsenosideRb18Notoginseng9NotoginsenosideR1,IdentificationofGinseng,AmericaginsengandNotoginseng,二、色谱法基本理论,拟解决的问题色谱相关术语色谱法理论的概况色谱中的动力学理论色谱分离情况的评价方法影响色谱分离的主要因素及条件选择（从理论的角度加以判断）,1、色谱相关术语,关于色谱峰关于保留值关于分配平衡,关于色谱峰的术语,峰,峰高,基线,峰宽,半峰宽,峰面积,标准偏差,关于色谱峰的术语,峰底宽、半峰宽及标准偏差三者的关系为：W=4，Wh/2=2.354拖尾峰伸舌峰鬼峰、假峰畸峰峰底基线漂移基线噪声谱带扩张,关于保留值的术语,死时间（t0，tM）：无保留组分出峰时间保留时间（tR）：调整保留时间（tR）：,关于保留值的术语,死体积（V0，VM）：保留体积（VR）：调整保留体积（VR）：,关于保留值的术语,相对保留值（ri,s）：相对保留值又称为选择性因子（）在气相色谱中，相对保留值的大小仅与固定相种类和柱温有关。,关于保留值的术语,保留指数（I）：又叫Kovats，它规定正构烷烃的保留指数是其碳数的100倍，其它物质的保留指数在实际色谱条件下测定。选取与被测物相邻的两种正构烷烃做参照系，其中一种碳数为Z，另一种为Z+1，被测物的保留指数由下式计算：,关于分配平衡,分配系数K（distributioncoefficient）,关于分配平衡,分配比k：又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在一定温度和压力下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。是衡量柱子对组分保留能力的重要参数。,关于分配平衡,相比：色谱柱内固定相和流动相体积之比是柱型及结构的重要特征。,2、色谱基本理论概述,研究理论的目的解决色谱峰的分离问题三个色谱基本理论问题色谱热力学问题发展高选择性色谱柱色谱动力学问题发展高效能色谱柱分离条件的最优化问题分离条件优化,3、色谱动力学理论,研究流出曲线展宽的本质及曲线形状变化的影响因素塔板理论速率理论,塔板理论,塔板理论将色谱柱比作精馏塔，通过概率理论得到流出曲线方程：,塔板理论,当t=tR时，C=Cmax，峰高正比于进样量W，是峰高定量的理论基础。当n越大，柱效越大，Cmax/W越大。即保留时间一定时，塔板数越多，峰越高。Cmax反比于tR，tR小，Cmax大，保留时间小的组分峰高且窄。tR大，Cmax小，保留时间大的组分峰低且宽。,柱效,由流出曲线方程导出：H=L/n,柱效,n是峰相对展宽的量度n是柱效的量度n是常数时，Y与tR成正比n越大，h越小，表明组分在柱中达到的分配平衡次数越多，对分离越有利，但还不能预言各组分有被分离的可能性。,塔板理论的贡献,塔板理论有助于我们形象的理解色谱的分离过程。导出色谱流出曲线方程，它符合高斯分布，与实验现象相吻合。导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价指标。,塔板理论的局限,塔板高度H是一个抽象的物理量，它的色谱本质是什么？它与哪些参变量有关，又怎样影响峰的扩张？对实验的指导意义有限。不能解释流速对理论塔板数的影响。有些假设不合理，如没有考虑纵向扩散对色谱分离的影响等。,4.色谱相关术语,关于色谱峰关于保留值关于分配平衡,关于色谱峰的术语,峰,峰高,基线,峰宽,半峰宽,峰面积,标准偏差,峰底宽、半峰宽及标准偏差三者的关系为：W=4，Wh/2=2.354拖尾峰伸舌峰鬼峰、假峰畸峰峰底基线漂移基线噪声谱带扩张,关于保留值的术语,死时间(tM):无保留组分出峰时间保留时间(tR):调整保留时间(tR):死体积(VM):保留体积(VR):调整保留体积(VR):,相对保留值(ri,s):保留指数(I)：又叫Kovats，它规定正构烷烃的保留指数是其碳数的100倍，其它物质的保留指数在实际色谱条件下测定。选取与被测物相邻的两种正构烷烃做参照系，其中一种碳数为Z，另一种为Z+1，被测物的保留指数由下式计算：,关于分配平衡,分配系数K(distributioncoefficient)分配比k又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在一定温度和压力下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。是衡量柱子对组分保留能力的重要参数。,相比色谱柱内固定相和流动相体积之比是柱型及结构的重要特征。,二、色谱分析法基本理论,研究理论的目的解决色谱峰的分离问题三个色谱基本理论问题色谱热力学问题发展高选择性色谱柱色谱动力学问题发展高效能色谱柱分离条件的最优化问题分离条件优化,1、色谱动力学理论,研究流出曲线展宽的本质及曲线形状变化的影响因素塔板理论速率理论,（1）塔板理论,推导塔板理论将色谱柱比作精馏塔，通过概率理论得到流出曲线方程：,为标准偏差,当t=tR时，C=Cmax，峰高正比于进样量C0，是峰高定量的理论基础。当n越大，柱效越大，Cmax/C0越大。即保留时间一定时，塔板数越多，峰越高。Cmax反比于tR，tR小，Cmax大，保留时间小的组分峰高且窄。tR大，Cmax小，保留时间大的组分峰低且宽。,对色谱流出曲线方程的讨论,柱效,由流出曲线方程导出：H=L/nn是峰相对展宽的量度n是柱效的量度n是常数时，Y与tR成正比n越大，h越小，表明组分在柱中达到的分配平衡次数越多，对分离越有利，但还不能预言各组分有被分离的可能性。,塔板理论的贡献,塔板理论有助于我们形象的理解色谱的分离过程。导出色谱流出曲线方程，它符合高斯分布，与实验现象相吻合。导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价指标。,塔板理论的局限,塔板高度H是一个抽象的物理量，它的色谱本质是什么？它与哪些参变量有关，又怎样影响峰的扩张？对实验的指导意义有限。不能解释流速对理论塔板数的影响。有些假设不合理，如没有考虑纵向扩散对色谱分离的影响等。,速率理论,速率理论是1956年荷兰学者VanDeemter等提出，因此又称作范第姆特方程运用流体分子规律研究色谱过程中产生色谱峰扩展的因素，导出了理论塔板高度与流动相线速度的关系，揭示了影响塔板高度的动力学因素,速率方程的导出,根据塔板计算公式：n=5.54(tR/Y1/2)2速率理论讨论的是色谱峰展宽原因，即影响塔板数n的因素，也就是影响塔板高度H的因素。H=A+B/u+Cu,涡流扩散项,A=2dp,涡流扩散项,均匀性因子,粒径,涡流扩散项,涡流扩散项A：由不等路径造成的色谱峰扩展。由于柱填料粒径大小不同，粒度分布范围不一致及填充的不均匀，形成宽窄、长短不同的路径，因此流动相沿柱内各路径形成紊乱的涡流运动，有些溶质分子沿较窄且直的路径运行，以较快的速度通过色谱柱，发生分子超前，反之，有些分子发生滞后，从而使色谱峰产生扩散。,分子扩散项,B/uB=2Dg,弯曲因子,扩散系数,分子扩散项,分子扩散项：由于分子的纵向扩散造成的色谱峰扩展。即由于试样组分被载气带入色谱柱后，是以塞子的形式存在于色谱柱的很小一段空间中，由于在塞子前后存在浓度梯度，因此使运动着的分子产生纵向扩散，引起色谱峰扩展,传质阻力项,气相传质阻力项,气相传质阻力项Cg：试样组分从气相移动到固定相表面的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子随流动相向前运动，发生分子超前，引起色谱峰扩展。,气相传质阻力项表达式,CguCg=,容量因子,液相传质阻力项,液相传质阻力项CL：试样组分从固定相表面移动到固定相内部的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子先离开固定相表面，发生分子超前，引起色谱峰扩展。,液相传质阻力相表达式,CLuCL=,液膜厚度,液相扩散系数,气相色谱中的速率方程,速率方程给我们的什么启示,为柱型的研究和发展提供理论依据为操作条件的选择提供理论指导为色谱柱的填充提供理论指导,对柱型研究和发展的影响,A=0?Golay1957年提出毛细管柱的概念（opentube）毛细管柱A=0，H=B/u+CuH，N，分离能力大大提高,对柱型研究和发展的影响,B=0?溶质在液体中的扩散系数DL10-5cm2/s溶质在气体中的扩散系数Dg10-1cm2/sDLDg当采用液体作流动相时B0液体作流动相时可用更细的固定相，AHPLC柱效比GC要高23个数量级,操作条件对柱效的影响,载气线速度（流速）的影响,最佳流速：u=(B/C)1/2实用最佳流速：比最佳流速更快A与流速无关B/u：当流速小时，对H的大小起主导作用Cu：当流速大时，对H的大小起主导作用,容量因子k的影响,不同组分k不同，测出的柱效不同在气相传质阻力相中，k，Cg理论上说k越小柱效越高，实际不可取在液相传质阻力相中，k，Cl先，后当k=1时，最大。希望k在一个合适的范围内，通过改变柱温，固定相，柱型参数等可实现。,柱温的影响,间接影响、十分复杂对k影响，对扩散系数影响，从而对柱效产生影响，但影响情况难以判断,对色谱柱的填充提供理论指导,柱径：根据速率方程，柱径越小，柱效越高，但柱径越小，固定相越难填充均匀。柱长L：柱长增加，总塔板数增加，但柱长增加，分离时间将增加。固定相粒径dp：根据速率方程，粒径减小，A项减小，C项减小，柱效增加。但粒径太小，不易填充，同时A项增大。,对色谱柱的填充提供理论指导,液膜厚度df：从柱效角度考虑，液膜越薄，柱效越高（根据速率方程），但允许的进样量减小。固定液与担体的配比一般在5:100-25:100之间，但现在更低配比的固定相也应用广泛。更重要的是：不同沸点的物质，应采用不同配比的固定相。,影响谱带扩张的其他因素,非线性分配色谱载体表面活性吸附中心造成的拖尾柱外效应色谱柱外引起色谱峰扩展的因素：如进样系统及进样方式、系统连接管、检测器死体积，检测器响应时间常数等因素引起的谱带宽展。,速率理论方程式的偶合式,H=(1/A+1/Cgu)-1+B/u+CluA=(1/A+1/Cgu)-1为偶合项已被普遍接受,2.色谱分离基本方程,对于常规分析工作，一般选用：选择性系数（相对保留值）与保留指数I来评价固定液有效塔板数N有效来评价色谱柱与分离条件以分离度R作为柱的总分离效能指标,（1）几个概念选择性系数,定义与相对保留值(ri,s)基本相同不同之处在于选择性系数是两个相邻峰的调整保留值之比（后峰比前峰，1），而不是被测物与标准物质的调整保留值之比（可小于1）它是评价固定液选择性的指标。选择性系数越大，该柱对此相邻峰的分离越好。,几个概念有效塔板数N有效,在气相色谱中，通常用有效塔板数N有效和有效塔板高度H有效来评价柱子的分离效能，它扣除了死体积对分离的影响，更好地反映了柱子的实际分离效能。柱效越高，该柱的分离能力越好。,几个概念分离度R,R越大，说明两组分分离得越好。由于该定义综合了色谱动力学和热力学因素，可作为色谱柱的总分离效能指标。,(2)色谱分离基本方程（Purnell方程）,公式推导,（3）色谱分离基本方程的启示,要改善物质对的分离（提高R），即提高两相邻物质的分离度，可以采取以下措施：提高柱效N提高选择性系数增大容量因子k,N的影响，如何提高N？,分离度R与理论塔板数N的平方根成正比关系，增加塔板数，有利于提高分离度。增加柱长可增加N，改善分离，但分析时间将大大延长，峰产生扩展。减小塔板高度H：根据速率方程的启示制备一根性能优良的色谱柱是十分重要的。根据速率方程选择合适的色谱条件同样有效。,K的影响，如何改变k？,分离度与容量因子有关，容量因子越大，分离越好。k135791113k/k+10.500.750.830.880.900.920.931.00但当容量因子大于10，k/(k+1)的改变不大，而分析时间将大大延长。因此，k的最佳范围是1100程序升温,具体的,汽化温度,一般进样方法下，汽化温度比柱温高30-70。进样量大时高一些好，保证瞬间汽化。保证不可超过试样的分解温度。其它气化温度与具体进样方式有关。,检测器温度,一般大于或等于柱温，具体与检测器种类有关。,进样量,液体试样一般进样量0.1-5l。气体试样一般进样量为0.1-10ml。具体视柱类型，固定液含量（不能超过柱容量）、进样方式、检测器的灵敏度和线性范围等确定。,流动相（载气）种类,流动相的种类要视检测器种类确定。常用的有氢气（热导用）、氮气（氢火焰用）、氦气（均可用，但价格较高）。氢气和氦气适合于快速分析。氮气做载气峰型较好，柱效较高。,三、色谱定性与定量方法,人参药材的HPLC图谱,5,1,人参皂苷标准品的HPLC色谱图,Rg1,Rb1,Re,丙二酰基人参皂苷Rb1,面积归一：Rg1=1.0%,Rb1=3.5%外标法：Rg1=0.2%,Rb1=0.5%,（1）色谱定性分析,利用保留值及其规律定性各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，因此保留值可作为定性指标。利用纯物对照定性利用文献值对照定性,纯物质对照定性,实现方法利用保留时间和保留体积定性,用相对保留值定性用已知物增加峰高法定性,应用范围：适用于简单混合物，对该样品已有了解并具有纯物质的情况。优点：应用简便，不需要其他仪器。缺点：定性结果的可信度不高。提高可信度的方法：双柱、双体系定性,文献值对照定性分析（GC）,实现方法测定相对保留值ri,s测定保留指数I优点：无需纯物质；保留指数具有较好的重现性和精密度；只与固定相和柱温有关。缺点：对结构复杂的物质，缺乏数据。适用范围：适用于简单混合物，无需纯物质。,与其它仪器或化学方法联合定性,离线联用方式化学法仪器法在线联用方式化学法仪器法,离线联用方式,收集方法：GC中一般采用液氮冷阱冷却后收集应用范围：无标准物时，可对较为复杂的混合物进行定性分析缺点：麻烦,在线联用方式,用化学方法辅助定性柱前反应：在色谱柱前装上预处理柱，带有某些官能团的化合物在预柱中发生物理化学变化，其色谱峰会消失或移动，与反应前色谱图比较，可初步判断试样中含那些官能团。柱后反应：在色谱柱后装上型毛细管分流器，将各组分导入官能团试剂反应管，利用官能团反应对组分进行定性。,与其它仪器联用定性混合物经色谱分离后，将各组分直接由接口导入其它仪器中进行定性。常用的联用方法有：GC-MS、GC-FTIR、LC-MS其它仪器相当于色谱仪的检测器。使用范围：复杂样品的定性。优点：不需要标准物，定性结果可信度高，操作方便。缺点：需要特殊仪器或设备。,GC-MS,（2）色谱定量分析,定量基础色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。在一定色谱条件下有：,定量要解决的问题,峰面积的测量和计算校正因子的测量与计算色谱定量方法及其应用,峰面积的测量与计算,积分仪或色谱工作站简便、速度快，精度高，可达0.2-2%，对小峰及不对称峰的结果准确，是色谱发展趋势。手动测量与计算,峰高乘半峰宽法：适于对称峰峰高乘峰底宽度法：适于矮宽峰峰高乘平均峰宽法：适于不对称峰峰高乘保留值法：适于狭窄峰，快速简便，常用于工厂控制分析。,重叠峰的测量,切线分峰垂线分峰,连线分峰计算机拟合分峰,校正因子的测量与计算,相对校正因子由于绝对校正因子与仪器的灵敏度有关，又由于灵敏度与实验条件相关，且每一检测器的灵敏度都是不同的，它不容易测量准确，亦无通用性，所以实际工作中使用相对校正因子。,相对校正因子的表达式,质量校正因子摩尔校正因子相对响应值,被测组分的质量,标准物质量,分子量,相对校正因子的测量,理论上相对校正因子与试样、标准物质、检测器类型、载气类型有关，与其它色谱条件无关。无纯物质时或对结果准确度要求不高时，相对校正因子可通过查表得。即无纯物，手册上又无数据时，可用一些计算方法估算这些物质的相对校正因子。,定量方法,校正归一化法含归一化内标法含内标标准曲线法外标法含单点校正,校正归一化法,推导：,应用范围：当试样中各组分都能流出色谱柱，且在检测器上均有响应，各组分峰没有重叠时，可用此法。优点：简便、准确，当操作条件如进样量等变化时，对定量结果影响很小，该法适合于常量物质的定量。缺点：对该法的苛刻要求限制了它的使用。,归一化法,若各组分的定量校正因子相近或相同，则上式可简化为：,内标法,推导将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称量的试样中。,适用范围：当只需测定试样中某几个组分，且试样中所有组分不能全部出峰时可用。优点：受操作条件的影响较小，定量结果较准确，使用上不象归一化法那样受到限制，此法适合于微量物质的分析。缺点：每次分析必须准确称量被测物和内标物，不适合于快速分析。,内标标准曲线法,fi,sms/m为常数K，此时Ci%=K(Ai/As)，以Ci%对Ai/As作标准曲线。优点：不必测校正因子，消除了某些操作条件的影响，方法简便，适合液体试样的常规分析。如白酒分析国标中采用此法。,外标法（标准曲线法）,用于常规分析优点：操作简单，计算方便。缺点：结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。该法必须定量进样。,单点校正,当被测试样中各组分的浓度变化范围不大时而用单点校正法。即配制一个与被测组分含量十分接近的标准溶液，定量进样，计算被测物的含量。,定量中的误差问题,样品的代表性（样品的前处理）进样系统的影响柱系统的影响测量误差定量结果的误差分析,习题课Page61-6221,33,
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