制药工程论文酶联免疫法概况及其在试剂盒试验中的问题

毕业论文（设计）题 目:酶联免疫法概况及其在试剂盒 试验中的问题类 另IJ:毕业综合实训总结报告院 系：药学院专业班级：学 号：学生姓名：指导教师：时 间:目录学位论文作者声明II摘要III关键词IIIAbstractIllKey wordsIll1酶联免疫法的基本介绍111酶联免疫法的历史发展11.2酶联免疫法的原理113酶联免疫法检测抗原抗体的方法1双抗体夹心法1双位点一步法1间接测抗体1134竞争法1捕获法11.4检测步骤11.4. 1实验用品1实验过程11.5酶联免疫法的应用12公司主要产品22. 1艾滋病毒诊断试剂盒（HIV-Ag/Ab. HIV-Ab） 22. 11主要组成成分22. 12试验原理22. 13试验过程22. 2丙肝抗体诊断试剂盒（HCV） 22. 21主要组成成分22. 2.2试验原理22. 23试验过程22. 3乙肝表面抗原诊断试剂盒（HBsAg） 22. 3.1主要组成成分22. 3.2试验原理22. 33试验过程324梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒（TP） 3241主要组成成分32. 4.2试验原理32. 4.3试验过程33影响实验的因素33. 1外在因素对实验的影响33. 11环境因素对实验的影响33. 12设备因素对实验的影响33. 2内在因素对实验的影响34降低影响实验的措施34.1解决环境因素的措施342解决设备因素的措施34. 3解决内在因素的措施45小结4参考文献4致谢5学位论文作者声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独 立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内 容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果 作品。本人完全了解有关保障、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向有关学位论文管理机构送交论文的复印件和电子版。同意 省级优秀学位论文评选机构将本学位论文通过影印、缩印、扫描 等方式进行保存、摘编或汇编；同意本论文被编入有关数据库进 行检索和查阅。本学位论文内容不涉及国家机密。论文题目：酶联免疫法概况及其在试剂盒试验中的问题作者单位：作者签名：年 月曰酶联免疫法概况及其在试剂盒试验中的问题摘要酶联免疫法是现在免疫分析技术中常用的一种方法，具有一泄的发展前景。本文主要介绍了酶 联免疫法法的一些基本情况，通过酶联免疫法的历史发展、原理、检测抗原抗体的方法.检测步骤、 酶联免疫法的应用五个方面对酶联免疫法进行简单的介绍。也对公司所用酶联免疫法生产的主要产 品试剂盒做了简单的介绍，主要产品有四种试剂盒，从试剂盒的主要成分、试验原理、试验步骤三 方而介绍。最后是分析实验过程中遇到的一些问题并提出解决方案，主要问题分为三个方而即环境 因素、设备因素和内在因素，再针对这三方面问题提出解决方案。关键词酶联免疫法基本概况：试剂盒：影响因素：措施The historical development and present situation of enzyme linkedimmunosorbent assayAbstractELISA is a method commonly used in immunoassay technology now has some prospects. This paper mainly introduces some basic situation of ELISA method. through the history of the development of ELISA method, antigen antibody detection principle, the detection step, five aspects of enzyme linked immunosorbent assay application of enzyme linked immunosorbent assay briefly. The main products of the company kit with ELISA method in production were briefly introduced. the main products are four kits, from the main component, kit test principle, test step three. The last is to analyze some of the problems encountered during the experiment in the proposed solutions The main problems are divided into three aspects, namely, environmental factors. equipment factors and internal factors, and then put forward solutions to these three problems.Key wordsBasic situation of enzyme linked immunosorbent assay： Reagent kit； Influence factor； Measures1酶联免疫法的基本介绍1.1酶联免疫法的历史发展最早于1896年由Herbert发明特异性凝集现象，Widal发明实验用于诊断伤寒，经过几十年的 发展，直到1971年由Engvall和Perlmann, Van Weeman和Schuurs建立了閒标记的故乡免疫测立技 术（ELISA），同年Rubenstein等建立了均相酶免疫测左技术。免疫技术的发展由自然的肉眼观察的 抗原抗体反应（沉淀反应，凝集反应）到加速肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术，分离技术）再 到标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性.再到半自动、自动化检验仪器与免疫反应 原理结合，加快了反应过程。最后到标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合。2酶联免疫法的原理使抗原或抗体包矯于固体载体表面上并保持英免疫活性。在实验时，将待检样品（检验样品中 的抗原和抗体）、酶标记的抗原或抗体和包被于固体载体上的抗原或抗体反应，反应一段时间后用洗 涤液将形成的复合物与其它杂质分开。复合物上的酶标记抗原或抗体与待检样品中的抗原抗体成一 种比例再让复合物与底物反应，酶将底物催化形成有颜色的物质，可以通过度数来分析待检样 品中抗原抗体的量。1.3酶联免疫法检测抗原抗体的方法1.3. 1双抗体夹心法双抗体夹心法在抗原抗体的检测中，用于抗原的检测多。在固体载体上提前包被抗体，待检样 品中的抗原、固体载体上的抗体、酶中的抗原三者反应。再通过酶与底物反应生成有色物质来分析 待检样品中抗原的量。双位点一步法双抗体法检测抗原的原理是利用抗原上的两个抗体决泄簇，待检样品中的抗原与板上的抗原还 有酶中的抗原反应，通过让待检抗原酶抗体与板抗原同时反应。这种方法既节省了时间又简化了操 作，当应用髙亲和力的单克隆抗体时会提高实验的灵敏度和特异性。间接测抗体间接法最常用于抗体的检测，待检抗体与酶标抗原结合后再跟固体载体上的抗体结合，通过固 体载体上抗体的量来确定待检抗体的量。即为间接法测抗体：51.3. 4竞争法竞争法既可以测抗原也可以测抗体。抗原抗体的检测方法一样，以检测抗体为例，待检样品中 的抗体与酶标记的抗体一起和固体载体上的抗原结合.待检样品中的抗体与酶标记的抗体形成竞争 关系。最后与固体载体结合的酶标记的抗体越少待检样品中的抗体越多，反之则越少。捕获法待检血淸中通常会存在与抗体特异性的IgM抗体和IgG抗体，在检测IgM抗体时IgG抗体会影 响IgM抗体的测圧。所以会用捕获法先将IgG抗体去除，先将IgM抗体与固体载体结合形成复合物。 再去除其它物质再检测IgM抗体减。14检测步骤1.4. 1实验用品实验用品有酶标板、生物素或样品稀释液（根据不同的用途进行选择）、酶标试剂、底物AB液、 阴阳性对照、质控品，还有实验过程中使用的仪器如加样器、洗板机、温箱、酶标仪等等。实验过程首先是加样，将血淸加到固体载体酶标板上，血淸中的抗原抗体与酶标板上的抗体抗原结合， 同时还要加阴阳性对照、指控品（阴阳对照可以看岀实验的本底是否正常，指控品可以看岀实验的 灵敏度是否正常），加完样后反应一段时间。待血淸中的抗原抗体与固体载体上的抗原抗体充分结合然后是加酶标试剂，酶标试剂上的抗原抗体与固体载体上的的抗原抗体结合形成复合物再是 加底物，酶和底物发生催化反应生成有色物质。最后是读数。15酶联免疫法的应用酶联免疫法一般用于一些传染病的检测，有病毒类、细菌类和一些蛋白质类，病毒类有甲型肝 炎类病毒、乙型肝炎类病毒、丙型肝炎病毒.戊型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体等等; 细菌类有结核杆菌.幽门螺杆菌等等。也有一些蛋白质类。有各种免疫球蛋白.甲胎蛋白等等。2公司主要产品公司产品包括体外诊断试剂盒、金标法快速诊断试剂、核酸、临床生化等检测试剂和临床检验 质控品以及疫苗等，公司产品众多，销售以体外诊断试剂盒为主，其它产品的销量比体外诊断试剂 盒的销量低得比较多，公司的主体还是以体外诊断试剂盒。目前公司还在研发用不同的方法来生产 试剂盒，目前还在研发阶段:J体外诊断试剂盒现在用的方法以酶联免疫法为主，体外诊断试剂盒 中又有不同的试剂盒，其中有四个大的项目，还有三十余个小项目。人类免疫缺陷病毒简称艾滋病 毒，丙型肝炎病毒简称丙肝，乙型肝炎病毒简称乙肝，四个大项目分别是艾滋病毒诊断试剂盒（酶 联免疫法）、丙肝抗体诊断试剂盒（酶联免疫法、夹心法、间接法）、乙肝表面抗原体外诊断试剂盒 （酶联免疫法）、梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）。每一种病毒对应一个项目，在这些小 产品中不全是病毒试剂盒，还有一些其它疾病的诊断用试剂盒。2.1艾滋病毒诊断试剂盒（HIV-Ag/Ab、HIV-Ab）艾滋病毒体外诊断试剂盒，公司产品有艾滋病毒抗原抗体试剂盒为HIV-4代产品、艾滋病毒抗 体试剂盒为HIV-3代产品。主要组成成分主要成分有酶标板、生物素试剂、酶标试剂、1型抗体阳性对照、2型抗体阳性对照、抗原阳性 对照、阴性对照、浓缩洗涤液、显色剂A、B液、终止液等等。试验原理本试剂盒采用双抗原夹心发和双抗体夹心法酶联免疫吸附试验原理，在微孔条上包被重组HIV 抗原和抗P24单抗，血淸中的抗体和微孔板上包被的抗原结合再配以生物素抗体双抗原形成双抗原 夹心，抗原和微孔板上包被的抗体再和酶标记抗原形成双抗体夹心。通过酶催化底物显色来检测何。 试验过程在做实验前将需要用到的实验用品提前准备好，实验用到的生物素、酶和一些指控品都是需要 4C条件储存，实验前需室温平衡半小时。第一步是加样，每板实验应设置三孔阴性对照，1型、2 型、抗原阳性对照个一孔，没孔加入生物素二十微升，空白孔除外，再在相应孔中加入待测样品或 阴阳性对照一百微升，轻轻振荡混匀并盖上盖板膜37C温冇一个小时。温冇完后用洗板机洗五次板, 最后一次洗板后用毛巾扣干，没孔加入酶标试剂一百微升盖上盖板膜37C温冇半小时，温冇完后再 洗板五次，最后一次用毛巾扣干，没孔加入显色剂A、B液五十微升后再次3厂C温育半小时，最 后温冇完没孔加终止液五十微升，用酶标仪读数，酶标仪波长为四百五十纳米。用空白孔调零后测 定各孔A值测。2. 2丙肝抗体诊断试剂盒（HCV）2. 2.1主要组成成分主要成分有酶标板、生物素试剂.酶标试剂、阴阳性对照、浓缩洗涤液、显色剂A、B液、终止 液等等。2. 2. 2试验原理本实验是运用双抗原夹心酶联免疫法检测待检血淸中的HCV抗体丄。微孔条上包被有抗原，微 孔条上的抗原、待检样品中的抗体和酶上标记的抗原反应。产生一种复合物，酶会催化底物生成有 色物质。若不显色则血淸中不含丙肝抗体；反之则含丙肝抗体。2. 2. 3试验过程实验前将实验用品从4C条件取岀放在室温条件平衡半小时，应在微孔板上设宜三孔阴性对照. 两孔阳性对照和一个空白孔。首先在微孔板上加五十微升生物素和五十微升待检样品37C反应一个 小时，反应结朿后在洗板机上洗五次板，最后一次用毛巾扣干，再在加了样品的孔中加入一百微升 的酶标试剂在37C反应半小时，反应完后再次洗板五次，洗完后在每孔加入底物A、B液齐五十微 升，反应半小时后加入终止液五十微升，最后在酶标仪上读数。2. 3乙肝表面抗原诊断试剂盒（HBsAg）2. 3.1主要组成成分主要成分有.酶标板、样品稀释液、酶标试剂、阴阳性对照、浓缩洗涤液、显色剂A、B液、终 止液等等。2. 3. 2试验原理本试验采用双抗原夹心法检测待检样品中HBsAg,在酶标板上包被表面抗体，待检样品中的表 而抗原与酶标板上的表面抗体和酶标记的抗体形成一种复合物，再通过酶催化底物显色。若显色则 样品中含有乙肝表而抗原：若不显色则样品中不含乙肝表而抗原问。2.3. 3试验过程将实验用品先平衡至室温，在微孔板上加入二十微升样品稀释液和一百微升的待检样品，在37C 条件下反应一小时后直接加五十微升的酶标试剂，加完酶后反应半小时，反应完洗板五次，洗完板 后加底物A、B液各五十微升，再反应半小时，反应完后加入五十微升的终止液即可读数。2. 4梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒（TP）2. 4.1主要组成成分A. B液、终止液等等。2. 4. 2试验原理本试验采用双抗原夹心法检测待检样品中的TP,在酶标板上预包被抗原,待检样品中的抗体、 酶标板上的抗原、酶标试剂中的抗原形成一种复合物，再通过酶催化底物显色。若显色则样品中含 有梅毒螺旋体抗体：若不显色则样品中不含梅毒螺旋体抗体：询。2.4. 3试验过程将实验用品先平衡至室温，在微孔板上加入一百微升的待检样品，在37C条件下温冇一小时， 再洗板五次.洗完后加入酶标试剂一百微升，同样在37C温冇三十分钟，温肓完后再次洗板五次， 在每孔中加入底物A、B液各五十微升温冇三十分钟，最后再加终止液进行读数。3影响实验的因素酶联免疫法在试剂盒中的运用主要是在检测试剂盒中的半成品酶标板、酶标试剂等等，还有使 用成品试剂盒时做的实验也是运用的酶联免疫法。在运用酶联免疫法检测半成品酶标板和酶标试剂 时很多因素都能决立实验的成败。这些因素分为外在因素和内在因素，外在因素又可分为环境因素 和实验时所用的物品设备因素。3. 1外在因素对实验的影响环境因素对实验的影响环境不仅对实验会造成影响，也会对实验用品造成影响，在实验室环境因素有温度的髙低和空 气中是否有异物漂浮，因为公司附近种植有许多柳树，45月份时柳树上就会有许多柳絮.柳絮也 会对实验造成影响，所以要确保实验室空气的淸洁。当实验室温度过髙或过低时对实验用品有很大 的影响，温度过髙会导致实验用品的活性丧失，导致实验的灵敏度和特异性降低，温度过低会导致 实验用品的活性不能恢复到正常水平，也会导致实验的灵敏度和特异性降低。设备因素对实验的影响实验时用到的实验仪器有加样器、温箱、洗板机等。做实验时加的样品.酶标试剂、质控品等 等都需用到加样器，要确保加样器的准确性，加样器上有刻度可以根据需要调肖加样器的刻度，但 是有些加样器的训节部分由于使用时间过长而变得不准确，导致调巧时不准确，加多了或加少了都 会导致实验数拯的不准确，实验数据就不可信。实验使用的温度是37C,温箱温度有时会升髙，髙 出适用范I忙 实验时温育的时间比较长，所以对温度的要求比较严格，高一点低一点会对实验造成 很大的影响。洗板机存在的问题主要是注水口和吸水口容易被堵住，因为加的待检样品中有些会有 絮状物，在洗板时就容易将注水口和吸水口堵住。导致洗的板子不干净使实验不准确翊。3. 2内在因素对实验的影响试验的用品自身被污染或有异物的话也会影响试验的准确性，试验用品是储存在4C条件，实 验前需先从4C条件中取出来放置至室温（室温放置30分钟左右），试剂等在用之前必须拧紧盖子, 防止被污染，试剂在加样时最容易被污染到，以为大多数时候加样都会加多孔这就增大了污染的几 率。酶标板在使用时也会很容易就污染到，在实验时需戴手套，而手套上有粉末，在使用酶标板时 不能直接碰到微孔条。4降低影响实验的措施4. 1解决环境因素的措施虽然有空调，但外而的柳絮还是能进实验室，建议在室外机部分再安装一层保护网，防止较大 的污染物通过室外机进入试验室。实验室温度可以通过空调来进行调节4. 2解决设备因素的措施由于设备使用时间长.慢慢会岀现各种问题，如温箱温度会变髙.加样器刻度的调肖不准确、 洗板机容易堵等等。建议公司安排维修人员圧期的对设备进行检查，当出现问题时能及时的检查维 修并弄淸出现故障的缘由能从根本上解决问题。因为维修时只是简单的维修，而并没有发现根本的 问题，从而导致设备的故障一次一次的出现。4. 3解决内在因素的措施这些内在因素主要是一些新入职人员存在着问题，由于刚接触这些可能对那些需要注意的细节 不熟悉，导致实验过程中出现问题，加大了公司的成本。建议公司能安排对新入职人员的培训，不 仅能提髙实验人员的专业知识，还能减少浪费减少成本。5小结ELISA诊断试剂盒近年来发展迅速.在国际市场内试剂盒的出现占据了重要的地位。就目前中 国市场而言，试剂盒的需求量日渐增大，试剂盒供应商也随之增加，推动着市场经济的发展。但随 之而来的就是某些商家而对激烈竞争时所采取的不正当手段，导致试剂盒市场出现鱼龙混杂的情况。 而对这一情况时，使用者还需谨慎对待寻找适合自己的产品。参考文献1 须卓斌，王旻.抗体与抗体药物的前世今生S自然杂志,2016, 04： 271-277.2 徐建平.猪蓝耳病检测卡与ELISA的对比分析S中国畜禽种业,20161, 06： 126-127.3 周志杰，刘珠果，戴秋云双抗体夹心ELISA法检测石头鱼毒素R军事医学,2016, 06:525-528.4 宋军，黄成斌，潘玲间接ELI端测抗体传染性法氏麥病病毒抗体方法的建立S 中国家 禽,2011,01:150-170.5 周鑫魁，洪霞，钱潼文，髙志莹，昊永宝，刘琦.克莱多巴胺ELISA间接非竞争检测方法的建立 S中外食品工业：下,20143, 026:15-206 杨瑞霞，蒋理，凌芸.2009年甲型及戊型肝炎病毒I訓抗体检测结果分析R江苏医 药,2011,10:1196-1198.7 吴立君用ELISA方法检测猪瘟病毒抗体水平的操作步骤及注意事项S 畜牧兽医科技信 息,2015,12： 26-27.8 陈雅楠，宋朝君，李琦，李娜，董芸，田莹，金伯泉，马樱.C反应蛋白单克隆抗体的制备及夹 心ELISA的建立及应用D 细胞与分子免疫学杂志,2016, 01： 103-105.9 谢文文.两种血淸铁检测试剂盒性能评价R国际检验医学杂志，2016, 17： 2473-247510 赵秋伶，史素青.酶联适体分析法检测痢萄酒中的赭曲籬素AJ.食品与生物技术学 报,2015,04:396-401.11 龚洪波.酶标仪双波长与单波长比色测左HBsAg的比较R中国社区医师,2015, 03:115-117.12 潘善越，于小汇，穆彩琴.电化学发光免疫分析法及酶联免疫吸附试验检测丙型肝炎抗体的效 果R社区医学杂志,2016, 13： 52-53.13 林雪茹，李树臣.乙型肝炎表而抗原左量检测临床研究进展R检验医学与临床，2016, 20： 2978-2979.14 徐战锋.多种不同梅毒检验方法检测梅毒螺旋体的结果准确率比较D疾病监测与控制杂志， 2017,03： 197-198.15 谭力明.ELISA法检测的影响因素及其对策R1试验与检验医学，2013, 04：300-305.致谢本次的毕业论文设计总结是在我的指导老师刘燕玲老师悉心指导下完成的。从毕业设计选题到 设计完成，刘老师给予了我耐心指导与细心关怀，有了老师耐心指导与细心关怀我才不会在实践的 过程中迷失方向，失去前进动力。刘老师有严肃的科学态度，严谨的治学精神和精益求精的工作作 风，这些都是我所需要学习的，感谢刘老师给予了我这样一个学习机会，谢谢！