中国湖北汉族人群对同种异型抗原免疫应答与HLA遗传多态性的相

中国湖北汉族人群对同种异型抗原免疫 应答与HLA遗传多态性的相关性【摘要】 目的研究个体之间混合淋巴细胞反应强度的差异，探讨 中国汉族人群对同种异型抗原的应答水平与HLA的相关性。方法 在17个家系中进行父/子和母/子间单向混合淋巴细胞培养。结果和结论不同组合的混合淋巴细胞反应强度,即父一子与子-父相比；母一子与子一母相比；父/子间与 母/子间相比，差异均无显著性。个体对同种异型抗原的免疫应答的强度与HLA-I类分子的型别相关,HLA-A10表型阳性个体的刺激指数 SI(0.95 0.24)明显低 于阴性个体(1.41 0.69),差异具有极显著性意义。【主题词】人类白细胞抗原同种异型抗原淋巴细胞 细胞，培养的Associati on betwee n the immune resp onse to alloa ntige ns and the gen etic polymorphism of HLA in a Hubei populati on of the Han natio nalityTU Zhe ngku n, WU Xio ngwe n, LIU Min, et al. Departme nt ofImmun ology, Tongji Medical Un iversity, Wuhan 430030【Abstract 】 Objective To study the differe nee in the magn itude of mixed lymphocyte culture react ion (MLC) among differe nt in dividuals and discuss the associati on betwee n the immune resp onse to alloantigens and the genetic polymorphism of HLA.Methods Wecarried out the on e-way MLC betwee n pare nts and childre n in seve ntee n Hubei families of the Han n ati on ality.Results and Con clusi onOurresults showed that, the difference in the magnitude of MLC was not sig nifica nt among various associatio ns in clud ing father vs son/son vs father, mother vs son/son vs mother and father vs son/mother vs son. The inten sity of the immune resp onse to alloa ntige ns were associated with the HLA class I phe no type, i nstead of the HLA-DRB1 alleles. The stimulation index (SI) of individuals bearing HLA-A10 antigen(0.95 0.24) was significantly lower (Pv 0.01) than that of HLA-A10negative ones (1.41 0.69).【Subject words 】HLAAlloa ntigenLymphocyteCell,cultured主要组织相容性复合体(MHC最初是在研究器官移植排斥反应的过程中被发 现的,MHC抗原作为代表个体特异性的主要组织抗原，在排斥反应中起关键作 用。本文分析家庭成员间混合淋巴细胞反应的强度，同时进行HLA遗传多态性的家系调查，探讨中国汉族人群对同种异型抗原的应答水平与HLA的相关性，以期为拓宽同种移植供体的选择范围提供实验依据。材料与方法1. 主要试剂：HLA-I类分型血清板(北京中日友好医院HLA配型室);3H-TdR(中科院北京原子能研究所);丝裂霉素C(mitomycin C)、RPMI 1640(美国 GIBCO公司);HLA-DRB1等位基因序列特异性引物(德国Essen大学Grosse- Wilde 教授惠赠)；Taq 酶、蛋白酶K、dNTP、琼脂糖(德国Boehringer Mannheim公司)。2. 研究对象：随机选择湖北省鄂州市汀祖镇王边村 17个健康家系(包括 父、母、子女各一名),米集外周静脉血标本。3. 方法(1) 外周血单个核细胞的分离。(2) HLA- I类抗原分型：采用国际通用的微量淋巴细胞毒试验。(3) HLA-DRB1基因分型：采用本室参考国外文献所建立的PCR/SSPT法。 混合淋巴细胞培养(MLC)：取上述单个核细胞作为应答细胞(0.5 x 106/ml);取单个核细胞悬液(0.5 x 106/ml)作为刺激细胞，加入丝裂霉素 C(终浓度25卩g/ml),37 C水浴20分钟后取出离心,细胞用RPMI 1640洗涤1次, 离心去上清，重新悬浮于含20% AB型血清的RPMI 1640培养液,调整细胞浓度为 0.5 x 106/ml备用;在同一家系的父/子或母/子间进行单向混合淋巴细胞培养,即 取刺激细胞和反应细胞各0.1ml加入96孔培养板，以自身混合淋巴细胞培养作 为对照(实验组与对照组每份标本均做 3个复孔),37 C 5% CQ培养5天,加入 20卩l浓度为740X 103Bq/ml的3H-TdR(终浓度为37x 103Bq/ml),轻轻摇匀后继 续培养18小时。应用B液体闪烁仪测定每分钟脉冲数(cpm),以下列公式计算 刺激指数(stimulation index,SI):上式中SIAmB弋表A细胞刺激B细胞的刺激指数，即A刺激B反应的cpm值 除以B被自身刺激细胞(Bm)所刺激的cpm值;SIBmA代表B细胞刺激A细胞的刺 激指数，即B刺激A反应的cpm值除以A被自身刺激细胞(Am)所刺激的cpm值。4. 统计学处理：用t检验分析实验结果。17个家系共50例标本的HLA-1类和HLA-DRB的分型结果见表1;17个家 系内各成员间混合淋巴细胞反应的 SI值及比较见表2、3 ;HLA- I类型别与SI 的关联见表4;HLA-DRB1等位基因型别与SI的关联见表5。结果显示，携带 HLA-A10表型者其SI(0.95 0.24)明显低于阴性者(1.41 0.69),差异有极显著 意义(P0.01);HLA-A1、-A2、-A11、-A24、-A25、-A33、-B62、-B46、-B40 等 表型以及HLA-DRB等位基因与机体对同种异型组织抗原的应答水平无明显关 联。本实验检出的其它HLA型别由于频率较低,无统计学意义。表1 HLA-1类表型和HLA-DRB基因型的家系调查Table 1. HLA class I phe no type and HLA -DRB1 allel in family an alysisNo.HLA-AHLA-BHLA-DRB170A2B16 B2771A2B16 B1372A2B16 B13DRB*120X*030173A2B62DRB*070X*090174A25B53DRB*0301*150X75A2 A25B62 -79-B6280A2B4681A2 A24B16 B46DRB*080X82A2-DRB*070X*090183A2-DRB*040X84A2-DRB*070X*040X85A11 A2B12DRB*160X*070X86A2 A10B39DRB*150X 100187A2B12 B39DRB*070X*100188A1 A2B5 B62DRB*070X*140X89A1B5 B4090A2 A1B62DRB*120X*070X91A25B7 B14DRB*070X92A2B5DRB*040X*090193-B5 B14DRB*040X*070X94A10B35DRB*070X*100195A24B40 B4696A10B40DRB*160X*070X97A33B17DRB*0901*070X98A24 A25B46DRB*150X*100199A33 A25B46 B17DRB*150X*0901100A2B46 B17DRB*0301101A1 A2B7 B62DRB*120X102A1 A2B46 B62DRB*120X*0301103-DRB*070X104-DRB*040X*110X105-DRB*070X*110X106A2B5 B15DRB*150X*120X107A2 A11B5 B46DRB*0901*120X108A2B5109A2 A10B40 B62DRB*080X*0901110A10B40 B17DRB*080X*120X111A2 A10B40DRB*090X*120X112A10 A24B62DRB*0901113A9B40114A9 A10B62 B40115A2 A10B46DRB*080X116A2 A10B39 B27117A2B46DRB*080X*040X118A2 A33B62119A2B62DRB*120X120A2 A33B62121A2B46DRB*080X*0901122A2B62 B39DRB*080X表217个家系中父/子和母/子间单向混合淋巴细胞反应Table 2.The stimulati on in dex(SI) of on e-way mixed lymphocyte react ion( MLR)i n seve ntee n families厂IS VSFMSSMSI70m72=1.68SI72m70=1.20SI71m72=0.71SI72m71=1.31SI73m75=1.38SI75m73=0.81SI74m75=3.39SI75m74=0.39SI80m81=1.25SI81m80=0.54SI82m84=0.54SI84m82=1.49SI83m84=0.61SI84m83=1.86SI85m87=1.32SI87m85=1.00SI86m87=1.31SI87m86=1.04SI88m90=2.55SI90m88=2.16SI89m90=3.51SI90m89=3.37SI91m93=0.88SI93m91=1.02SI92m93=1.06SI93m92=1.10SI95m96=1.01SI96m95=0.52SI97m99=0.99SI99m97=1.43SI98m99=1.40SI99m98=1.21SI100m102=0.98SI102m100=0.77SI101m102=1.85SI102m10 仁0.99SI103m105=1.94SI105m103=1.01SI104m105=1.40SI105m104=0.57SI106m108=0.80SI108m106=1.48SI107m108=0.69SI108m107=1.45SI109m11 仁0.75SI111m109=0.79SI110m11 仁1.00SI111m110=0.60SI112m114=0.72SI114m112=1.18SI115m117=1.52SI117m115=1.43SI116m117=1.17SI117m116=0.98SI118m120=1.17SI120m118=1.31SI119m120=1.17SI120m119=1.72SI121m122=1.11SI122m12 仁0.55Note:F=father,S=s on,M=mother表3父/子和母/子间单向混合淋巴细胞反应的比较Table parisi on of stimulati on in dex of on e-way mixed lymphocyte reaction in fathers/children and mothers/childrenS3 RC；SIFS1.22 0.51SF1.17 0.38MS1.43 0.84SM1.17 0.72Note:F=father,S=s on,M=mother;SC=stimulati ng cells,RC=resp on di ng cells,SI=stimulatio n in dex表4 HLA-1类抗原表型与MLC反应强度的关联Table 4.Associati on betwee n class I HLA phe no type and stimulati onin dex of mixed lymphocyte reacti onHLA alleleStimulati on in dexP valueA10(+) (n=8)0.95 0.24(-)(n=44)1.41 0.690.05B40(+) (n=8)1.09 0.93(-)(n=44)1.58 0.610.05B39(+) (n=4)1.11 0.12(-)(n=48)1.26 0.670.05A1 (+) (n=4)1.49 0.60(-)(n=48)1.23 0.660.05A2 (+) (n=32)1.33 0.45(-)(n=20)1.05 0.340.05A25(+) (n=5)1.39 0.94(-)(n=47)1.23 0.620.05A33(+) (n=3)1.24 0.16(-)(n=49)1.25 0.690.05表5 HLA-DRB等位基因与MLC反应强度的关联Table 5.Association between DRB1 alleles and stimulation index ofmixed lymphocyte react ionHLA-DRB1 allelStimulatio n in dexP valueDRB*070X(+)( n=14)1.38 0.76(-)(n=23)1.16 0.410.05DRB*120X(+)( n=9)1.54 0.82(-)(n=28)1.14 0.420.05DRB*040X(+)( n=7)1.03 0.44(-)(n=30)1.32 0.610.05DRB*0901(+)( n=9)1.07 0.28(-)(n=28)1.31 0.640.05讨论人的MHO HLA复合体,是位于人类第6染色体短臂上的一个紧密连锁的基 因群。HLA抗原的主要功能是参与抗原提呈和免疫调节，它控制人类对各种抗原 的免疫应答，也与某些疾病的遗传易感性有关。在器官移植中,HLA抗原作为一 类重要的同种异型抗原，决定着供者与受者间的组织相容性，是导致移植排斥反 应的关键因素。文献已报道，移植与受者HLA全相同的供体器官，其长期存活率 是HLA不相符者的2倍或更高1-5。但由于HLA分子的高度多态性,在随机人 群中寻找HLA全相同的供体相当困难。临床上，仅10%勺患者有可能获得HLA比 较一致的移植物。实践中早已发现，由于对同种异体抗原的免疫应答水平存在个体差异，在某 些HLA不相符的供受者间进行器官移植,也可能获得比较好的疗效7。另外，临 床上在HLA全相同的同胞间进行骨髓移植的资料表明8：:携带HLA-B7单体型的 个体,移植物抗宿主反应（GVHR发生率明显较低（P0.01）;而携带HLA-B44单体型的个体,其GVHRg生率明显较高（PvO.01）。由此提示,可根据移植后是否发生 宿主抗移植物反应（HVGR或GVHR将供、受者间不完全相同的 HLA型别的相配,9，10。两类9分为免疫原型 (immunogenic mismatch) 和兼容型 (permissible mismatch)在HLA兼容者间进行移植，其移植物存活率明显高于免疫原型个体 在体外实验体系中，供、受者之间的兼容性主要表现为 MLC中淋巴细胞的增殖程 度明显较低。本实验对 17 个家系进行父 /子和母/子间单向混合淋巴细胞培养。结果发 现,不同组合的混合淋巴细胞反应强度,即父一子间与子一父间相比；母一子间与 子一母间相比；父/子间与母/子间相比，均无显著性差异（见表3）。实验结果还 发现,个体对同种抗原免疫刺激的应答水平与HLA-1类分子的型别相关,HLA-A10表型阳性个体的SI（0.95 0.24）明显低于阴性个体（1.41 0.69）,差异有极 显著性意义（P0.01）。本实验未发现其他HLA-1类表型或HLA-DRB等位基因 与机体对同种抗原的应答水平相关。HLA分子是人类体内具有最复杂多态性的遗传系统。随着对HLA分子结构的深入了解，发现某些不同型别的HLA抗原，其分子结构具有极大的相似性，如 HLA-B51和B52仅有两个氨基酸不同“。进一步研究还发现，同一 HLA家族（如 A2家族），甚至不同家族的HLA同种异型分子（如A*0301和A*1101）,其抗原结合 槽（cleft）所容纳的抗原肽可有相同或相似的锚定残基或肽链基序，称为超基序（supermotif）。在HLA-1类分子中，已鉴定出A3 B7、A2、B44这4种主要的 超基序家族成员12。因此,虽然在经典理论上，供体和受体间HLA型别的任何差 异均可被视为具有免疫原性，但现代观点认为，不能仅以HLA是否相同来判断 供、受体之间是否为免疫原性 9 。临床上对同种异体移植的回顾性研究表明:某些受者可识别来自供体的、与自身不相同的HLA;而某些受者则不能识别 9,13,14 本课题借助体外MLC实验体系证实：人群对同种异体抗原的免疫应答存在着 明显的个体差异，表现为携带不同HLA型别的个体对同种异体抗原的免疫应答水 平各异（见1, 2）。携带HLA-A10表型的个体，其对携带一条相同单体型的供体 细胞，仅产生较低的免疫应答；换言之，携带HLA-A10表型的个体，其对具有一条 相同单体型的供者可能表现为“兼容性”。由此推测，某些MH（抗原多肽可能被 携带特定MH（型别的受者所识别，而不能被携带其它型别的受者所识别9。这 一现象, 对拓宽同种异体器官移植的供体选择范围和提高移植物的存活率 , 具有 极其重要的意义。作者单位：涂正坤 510180 广州市妇婴医院医学遗传研究所 吴雄文，刘敏，姜晓丹，杨志章，吴锋，龚非力，赵修竹 同济医 科大学免疫学教研室 参考文献1 Takemoto S,Terasaki PL,Cecka JM, et al. 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