与胶质瘤恶性表型相关性研究

NAD（P）H氧化酶与胶质瘤恶性表型相关性研究负载供肾抗原的DC2细胞延长大鼠移植肾存活观察（作者）摘要：【目的】 检测NAD（P）H氧化酶及ROS在不同恶性程度胶质瘤中的表达，探讨NAD(P)H氧化酶及细胞内ROS对胶质瘤存活、增殖、凋亡以及恶性表型的影响。观察负载供肾大鼠抗原的DC2（未成熟DC）在体内特异性抑制急性排斥反应及其对移植物的功能和存活时间的影响。【方法】体外制备并诱导分化未成熟的优势淋巴系DC前体细胞（DC2），进行免疫表型分析，健康成年BN大鼠和Lewis大鼠各57 只，BN大鼠为供者，Lewis大鼠为受者，随机分为4 组，术前负载供肾大鼠抗原和无关供肾抗原，观察DC2体外抑制混合淋巴细胞反应（MLR）的情况，构建大鼠同种异体肾移植模型，观察其在体内特异性抑制移植排斥反应发生的情况，Kaplan-Meier生存分析研究对移植物的存活时间的影响。【结果】所制备的DC2经供肾大鼠抗原负载对MLR具有抑制作用（P0.05），负载供肾抗原DC2输注的大鼠肾移植术后中位生存时间是625.53 天，负载无关大鼠抗原和不负载抗原输注后移植实验组，术后中位生存时间分别是303.95 天和274.74 天，实验组与对照组血清肌酐，炎症因子IL-4和IL-10等表达，差异具有统计学意义(P0.05)。【结论】大鼠同系受体来源的负载供肾抗原的DC2具有体外抑制MLR的作用，能够预防和抑制急性排斥反应的发生，延长生存时间，提高远期存活率。中图分类号：R322.6+1 文献标识码：A 文章编号：1672-3554（2010）关键词：树突状细胞；大鼠；骨髓细胞；抗原；同种异基因肾脏移植；急性排斥反应；免疫耐受Abstract: 【Objective】To observe the specific inhibition to the acute rejection of the rat kidney antigen conditioned DC2 (immature DC) in vivo and its effect on graft function and survival time. 【Methods】To prepare in vitro immature precursor lymphoid DC (DC2), analysis the immunophenotype, 57 adult BN rats and Lewis rats were separately recruited into experiment，BN rats are donor, Lewis rats are recipient，they were randomly divided into 4 groups. Then condition the DC2 with donor rats kidney and unrelated kidney antigens, observe its inhibition of mixed lymphocyte reaction (MLR ) in vitro, construct the allogeneic rat kidney transplantation model of, observed specific inhibition of allograft rejection in vivo, use Kaplan-Meier method to analysis survival time of graft. 【Results】The rat kidney antigen conditioned DC2 inhibited MLR (P0.05), the median survival time of the rats conditioned with the donor rats kidney antigen after renal transplantation were 625.53 days, but that of the independent kidney antigen conditioned or non-antigen conditioned groups were 303.95 and 274.74 days. The peripheral blood creatinine, inflammatory cytokines IL-4 and IL-10 expressions of the experimental groups was statistically significantly different，P0.05. 【Conclusion】The DC2 conditioned with kidney antigen of the allogeneic donor rat has the role to inhibit the mixed lymphocyte reaction (MLR ) in vitro, to prevent and suppress the occurrence of acute rejection and prolong the grafts survival time and improve the long-term survival rates.Key words: Dendritic cells; Rat; Allogeneic Kidney Transplantation; Acute Rejection; Immune Tolerance朗读显示对应的拉丁字符的拼音朗读显示对应的拉丁字符的拼音基金项目：广东省自然科学基金（优势DC2防治GVHD效应的实验研究07001683）；广东省科技计划项目（负载供肾抗原的优势DC2细胞延长大鼠移植肾存活时间的实验研究，2010B031600052）作者简洁：纳宁（1974-），男，回族，宁夏银川人，博士研究生，主治医师，E-mail:nn_gg2002 ；高新，教授（博士生导师）,通讯作者，E-mail: gaoxin44在同种异体组织、器官移植时，受者的免疫系统常常对供体移植物产生排斥反应（transplant rejection），这是一个十分复杂的免疫学过程，往往涉及细胞介导和抗体介导的多种免疫损伤机制。诱导移植耐受可以大大降低免疫抑制药物的使用，甚至可以停用免疫抑制药物，这对于社会和病人的影响是巨大的1-2。树突状细胞（Dendritic cells,DC）是目前可知的功能最强的专职性抗原提呈细胞（APC），而且是唯一能活化从未经历过抗原的初始T细胞的APC。近年来的研究表明，某些特定亚群的DC(DC2或称未成熟DC)显示出具有抑制体外同种异体混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction, MLR)、维持自身耐受的功能，并发现同种异体器官移植中由受体DC 所进行的抗原间接提呈别比直接提呈别更为重要3-5，本研究进一步通过影响体外DC的成熟过程进而起到间接调节免疫反应的作用，这为探索预防和治疗临床上急、慢性移植排斥反应提供了一个新的思路。通过建立大鼠同种异基因肾脏移植动物模型，观察负载供肾抗原的DC2体内特异性抑制急性排斥反应的情况、探讨其可能存在的生物学效应机制，为DC2过继免疫新疗法诱导特异性免疫耐受的临床应用打下坚实基础。1 材料与方法1.1实验动物与试剂Lewis雄性大鼠80只，鼠龄8-10周，体重26030 克；BN（Brown Norway）大鼠65只，鼠龄8-10周，体重25050 克；Wistar雄性大鼠10 只，鼠龄8-10 周，体重24020 克，均购自中山大学实验动物中心，饲养条件和实验条件均符合SPF（Specific Pathogen Free）级标准。rrGM-CSF、rrIL-4、Flt3L（购自Invitrogen公司）；IL-4 ELISA Kit（KeyGen公司）；FITC-CD40-M-ab、FITC-CD4-M-ab等（购自美国BD公司），MLR Cell Counting Kit（购自日本Dojindo公司）；FITC-CD11c-M-ab（购自Antigenix America公司）；Total-RNA extraction kit、Quantitative PCR kits（购自TAKARA公司）；DMEM（美国Gibco），胎牛血清（中国天津中科院灏洋生物工程有限公司），6孔、24孔和96孔细胞培养板（美国Corning）。1.2受体Lewis大鼠DC2细胞体外培养方法的建立取SPF级810周龄雄性Lewis大鼠，基本参照Inaba的方法6，体外获得DC2细胞，调整细胞浓度为4106 /ml，7、5%CO2的培养箱中培养5h，用4种重组大鼠的细胞因子GM-CSF 5ng/ml、IL-4 20 ng/ml、Flt-3L 25 ng/ml、SCF100 ng/ml 组合作为诱导剂7,8，分别观察骨髓细胞在3 d、6 d、14 d、21 d情况下的DC细胞的数量和纯度。加入相应的荧光抗体和同型对照抗体1g， FITC标记小鼠抗大鼠MHC(OX6)、OX62和CD86单体（FITC Mouse IgG1, Isotype Control）等9，流式细胞术检测诱导与不诱导条件下树突状细胞（DC2）的比例和分布；通过相差显微镜、透射电镜、电镜和免疫荧光等多种方法观察细胞形态。1.3体外观察上述制备的DC2对MLR（混合淋巴细胞反应）的抑制作用无菌条件下分别取BN和Wistar大鼠肾脏，将皮质组织碾磨成组织匀浆，制成细胞碎片悬液也即为肾脏抗原，将上述培养的DC2细胞负载BN大鼠肾脏抗原，按照1:10（V/V）的比例向DC2细胞悬液中加入供肾组织过滤液继续培养。制备BN和Lewis大鼠脾细胞，MTT比色法检测不同细胞密度的负载供肾抗原的DC2刺激同系T细胞增殖反应。1）MLR加DC2组：经丝裂霉素C处理的、诱导第3天受体来源的负载BN大鼠肾脏抗原的DC2，按每孔4104、1105、1.6105、2105 个（与反应T细胞比例分别为0.2:1，0.5: 1，0.8:1，1:1）的梯度加入同种MLR体系中，37，5CO2共培养3 天，MTT法检测；2）同种MLR组，即阳性对照组，以2106 个经丝裂霉素C处理的BN大鼠的脾T细胞为刺激细胞，2105 个 Lewis大鼠的脾T细胞为反应细胞，MTT法检测；3）阴性对照组，未加刺激细胞的Lewis大鼠脾T细胞2105 个/孔作为本底。各实验组的OD值均为减去阴性对照的平均吸光度后的数值。1.4大鼠肾脏移植动物模型的建立健康成年BN大鼠和Lewis大鼠各57 只，均为雄性，BN大鼠为供者，Lewis大鼠为受者，随机分为4 组，将上述分别负载BN和Wistar大鼠肾脏抗原的DC2细胞、未负载抗原的DC2，细胞浓度调整为1106 个/ml后，用于回输大鼠，具体分组如下：（1）实验组1（16 例），负载BN大鼠肾脏抗原的DC2-A细胞液1 ml回输入受者大鼠体内；（2）实验组2（16 例），负载Wistar大鼠肾脏抗原的DC2-B细胞液1 ml回输入受者大鼠体内；（3）实验组3（16 例），未负载抗原的DC2-C细胞液1 ml回输入受者大鼠体内；（4）对照组（9 例），细胞培养液1 ml回输入受者大鼠体内。其中，实验组1、2、3每组再分为5 天组（3 只）、14 天组（3只）和生存时间组（10 只）三个亚组；实验组4再分为5 天组（3 只）和生存时间组（6 只）。实验组1、2、3和4 组分别于回输各自对应的DC2细胞液和细胞培养液7 天后，采用水合氯醛腹腔麻醉下，采用改进的Kamada10-11大鼠原位肾移植法。1.4.1术后一般生命指标和存活时间观察:肾移植手术后将受体Lewis大鼠置于单笼饲养3 天，术后数小时即可饮食水。观察大鼠饮食、活动能力、体位改变、眼睛、腹部、毛发、体重和精神状态等变化。各实验组预留10 只，对照组预留6 只移植大鼠便于观察术后长期存活时间，做生存分析。1.4.2血清血检测和组织形态学观察。实验组1、2、3各实验组分别于模型建立后第5 天和第14 天两个时点随机处死各3只大鼠；对照组于第5天随即处死3 只大鼠，取下腔静脉抗凝血0.5-1 ml荧光定量PCR（ELISA）检测其外周血细胞因子IL-4、IL-10、IFN-指标；再取另外23 ml血样本离心(4，4000 rpm 10 min)，取上清液约600 ul，-80 低温冰箱保存待测，待各组标本齐备后，全自动生化分析仪检测肌酐水平。同时摘取每组若干来源于Lewis受体的BN大鼠供体肾脏组织用10%中性福尔马林固定，石蜡切片，HE染色，光镜下观察病理组织切片，若每一时点如有因手术技术、出血、感染等原因导致死亡的动物，均给予补齐。1.4.3荧光定量RT-PCR检测移植后各组外周血单核细胞中细胞因子IL-4、IL-10和IFN-的mRNA表达水平设计IL-4、IL-10和IFN-基因的mRNA Real time PCR实验的引物和探针序列，选择-actin基因作为内参，取上述200 l外周血液加入1 ml红细胞裂解液充分洗涤提取总RNA，以之为模板，逆转录成cDNA，按照5PCR buffe 10 l、各检测因子（IL-4、IL-10、IFN-和-actin）上下游引物各15 pmol、荧光探针15 pmol、10 mmol dNTPs 1 l、Taq DNA聚合酶3 U、阳性定量模板或cDNA 5 l、加无菌去离子水补足至总体系为50 l，循环条件如下：93 3 分钟，然后93 30 秒，55 45 秒，72 45 秒，共40循环，ABI 7500荧光定量PCR扩增仪收集并储存数据。最终计算结果目的基因/内参基因分析目的基因的表达水平。表1 Real Time荧光定量RT-PCR的引物和荧光探针Table 1 Primers and fluorescent probes of Real Time Quantitative RT-PCR检测因子 引物和探针序列5-3 目的基因片段Forward Primer: 5-CCACGGAGAACGAGCTCATC-3 IL-4 Reverse Primer: 5-ACCGAGAACCCCAGACTTGTT-3 Probe：5FAM-GCTTCCAGGGTGCTTCGCAAATTT-TAMRA3, 104 bpForward Primer: 5-CCTGGCTCAGCACTGCTATG-3 IL-10 Reverse Primer: 5-ACTGGGAAGTGGGTGCAG TT-3 Probe：5FAM-GCCTGCTCTTACTGGCTGGAGTG-TAMRA3 , 101 bpForward Primer: 5-TCATCGAATCGCACCTGATC-3 IFN- Reverse Primer: 5-CCTCGAACTTGGCGATGCT-3 Probe: 5FAM-GTAAAGCAAAAAAGGATGCATTCAT-TAMRA3, 84 bp Forward Primer: 5TCTGTGTGGATTGGTGGCTCTA3-actin Reverse Primer: 5 CTGCTTGCTGATCCACATCTG3 Probe: 5FAM-CCTGGCCTCACTGTCCACCTTCC-TAMRA3, 102 bp1.4.4不同实验组受者大鼠血清肌酐水平试验用自动生化分析仪测定受者大鼠血清肌酐水平。1.4.5组织形态学的病理切片的制作受体鼠移植肾取材时间，对照组受体鼠术后第5 天处死3 只取材保存备用；实验组1、2、3的5 天亚组、14 天亚组受体鼠分别在肾移植术后第5 天和第14 天各处死3 只(处死前均活着)取材备用。光镜下观察移植肾脏病理组织形态学改变。2 结果2.1优势DC2的制备、形态学观察和表型鉴定2.1.1 形态学和生长特点细胞因子诱导的实验组：诱导至第3 天即可观察到典型的半悬浮细胞团块，多数细胞呈半悬浮或悬浮状生长，松散贴壁，随着天数增加观察发现越来越多的细胞表现出巨噬细胞样形态，至第21 天，细胞体积缩小，表面毛刺明显减少。未经过磁珠纯化的大鼠骨髓细胞在高密度培养第3 天，四种细胞因子组合作诱导剂诱导的实验组DC中的DC2经流式细胞仪检测其纯度可以达到94.87% （DC2占总DC比例），实际DC2的含量可达到（1.430.06）106 /ml，并且该组骨髓细胞总数（4.50.13）106 /ml略高于起始接种第1 天的细胞总数（4.00.19）106 /ml。四种组合细胞因子诱导的骨髓实验组诱导后第3 天的细胞，采用流式细胞仪检测单核表面的OX62（大鼠相对特异性的表面分子标志物）高达82.30%；而MHC II类分子（OX6）和共刺激分子(CD40和CD86呈现低水平表达（分别为37.73%、38.20%、38.66%），说明其抗原呈递能力减弱；大鼠DC2其他表面标志如：CD3（1.95%）和CD11c（2.41%）呈阴性表达，CD4（83.49%）呈阳性表达（附图3），符合需要的DC2特征。表2. 骨髓细胞在不同诱导条件不同时间下的总细胞密度（106 /ml）Table2 Total Density of Marrow cells induced at different time under different conditions ( 106/ml)分组第1 天第3 天第6 天第14 天第21 天细胞因子诱导的实验组4.000.194.50.13*2.80.47*0.360.02*0.330.06*无外源细胞因子对照组4.000.162.90.211.240.140.130.040.120.07*表示与无外源性细胞因子对照组相比差异有统计学意义，P0.05。2.1.2体外观察上述制备的优势DC2细胞对MLR的抑制作用MLR结果表明，负载供肾抗原的DC2对MLR均具有抑制作用（P0.05），比值大于0.2时抑制作用差异具有统计学意义（P0.05），并随着加入的DC2数目的增加抑制作用渐增强，当DC2/反应细胞为1:1左右时达到最大抑制效果，激发同系淋巴细胞增殖的能力最弱，差异有统计学意义（P0.05）。图1 同系负载供肾抗原的DC2体外对MLR的抑制作用Fig 1 Inhibition of the MLR of the allogeneic donor kidney antigen conditioned DC2 in vitro The suppressive effect of syngeneic Predominant DC2 with antigen of donor on MLR in vitro . That of pred DC2/ responder cell 0.2 group and MLR group compared with Lewis pred DC2/ responder cell 0.5、0.8、1 groups , P0.05.2.2大鼠肾移植动物模型的建立移植模型成功建立，肾脏移植手术时间(140 20) min,其中热缺血时间(122.4) min，冷缺血时间(235.3) min，静脉吻合时间为(120.6) min,动脉吻合时间为(160.5) min。2.2.1 生命体征和一般情况观察大鼠肾移植术后将其置于单笼饲养3天，负载供肾抗原的DC2组的大鼠恢复良好，一般状况较好；对照组大鼠一旦出现急性排斥反应时，临床情况急剧恶化，呈现衰竭状态，表现为消瘦，毛发蓬松或者脱落，缺乏光泽，角膜反射迟钝，腹部包块形成，少尿或者无尿，出现腹泻等症状。负载无关抗原的DC2和未负载抗原的DC2组仅仅表现为活动减少，对外界反应刺激减弱，进食减少，但是大小便存在，只是尿量稍减少。2.2.2生存期的观察：观察移植大鼠术后存活时间并制作生存分析曲线。实验1、2、3 组各有10 只和对照组6 只观察生存时间，可见实验组1术后生存时间的中位数是625.53 天，存活时间最长；实验组2和实验组3生存时间的中位数分别是303.95天和274.74天；而对照组生存时间最短，中位数是60.82 天（表6）。实验组1与实验组2、3、4相比，差异具有统计学意义P0.05；实验组2、3组与实验组4之间差异具有统计学意义P0.05（表5）。说明未负载抗原和负载无关抗原对肾移植大鼠远期存活率影响意义不大，只有输注负载供肾抗原的优势DC2的才可明显延长远期存活时间（附图5）。表4 各实验组肾移植术后生存时间Table 4 Survival time of each experimental group after renal transplantation组别只数n生存时间（天）中位生存时间（天）95%可信区间实验组11053,72,59,79,91,62,47,39,73,6662(51,73)实验组21028,33,39,19,30,46,22,19,37,3430(22,38)实验组31022,33,51, 14,27,38,18,23,36,2927(18,36)实验组466, 10, 7,6,9, 56(4,8)图2 各实验组肾移植术后生存分析曲线图实验组1 vs 实验组2、3、4有显著性差异， P0.05；实验组2、3 vs 实验组4有显著性差异， P0.05Fig 2 Survival curve after experimental groups of renal transplantation2.2.3血清血检测和组织病理切片结果2.2.3.1 荧光定量RT-PCR检测大鼠肾移植术后各组外周血单核细胞中各细胞因子（IL-4、IL-10、IFN-）mRNA表达水平如图5，细胞因子IL-4、IL-10、IFN- mRNA表达：实验组1 vs 实验组2、3、4差异具有统计学意义， P0.05。图3 移植后各实验组外周血单个核细胞的细胞因子mRNA表达图表Fig 3 Chart of peripheral blood mononuclear cells cytokine mRNA expression of each experimental groups after transplantation 2.2.3.2移植后不同实验组不同时间受者血清肌酐水平检测实验组 1、2、3和4受体鼠于术后第5天和实验组1、2、3受体鼠于术后第14 天各取下腔静脉抗凝血2-3 ml样本用生化分析仪测定肌酐水平，移植后第5 天和第14 天各组血清肌酐水平（umol/L），实验组1与实验组2、3、4比较差异具有统计学意义，P0.05。图4 移植后各实验组在第5天和第14天血清肌酐水平的比较Fig 4 Compararation of serum creatinine levels of each experimental group on 5 days and 14 days after transplantation 2. 2.3.3 移植后不同实验组的肾脏病理组织形态学观察 病理组织形态学检查提示，对照组出现急性排斥反应的病理改变，光镜下可见大量的单个核炎症细胞浸润，肾小管坏死溶解改变明显，小动脉纤维素样坏死，甚至有些肾小球出现出血型炎症；实验组1病理示肾小球、肾小管结构正常，未见静脉充血或者动脉出血，仅有少量灶性的单核细胞浸润；未见纤维化改变，偶有间质轻度水肿，无间质出血和肾小管的坏死。实验组2和实验组3病理改变接近相似，仅间质浸润的单核细胞较负载供肾抗原DC2组稍增多，也无间质出血和肾小管的坏死。 实验组-1 5th Day -X200 实验组-1 14thDay X200 实验组-1 14thDay X400 实验组2 5th Day X400 实验组-2 14th Day X400 实验组-3 5th Day X400 实验组-3 14th Day X400 实验组4 5th Day X400图5：肾移植术后第5天和第14天病理切片Fig 5 The athological pictures on 5 and 14 days after kidney transplantation3 讨 论3.1不成熟DC2的制备及意义同种异体移植排斥反应是当前器官移植领域所急需解决的最大难题，诱导受体抗原特异性免疫低下状态或免疫耐受是同种异体器官移植追求的理想目标。研究表明通过影响DC的成熟过程可以起到间接调节免疫反应的作用，这为探索预防和治疗临床上急、慢性移植排斥反应提供了一个新的思路。由于DC重要的免疫学功能，因此如何获得大量的纯化的DC 就成为进一步研究DC特性及功能的前提。本研究通过GM-CSF+IL-4+SCF+Flt3L四种细胞因子组合在体外诱导骨髓造血干细胞制备出耐受性DC2，第3 天可以获得大量的DC2细胞，纯度高达94.87，流式细胞仪检测的结果表明，采用上述四种组合细胞因子诱导所产生的主要是未成熟的DC2，表面低表达的MHC类分子（OX6）和协同刺激分子（CD40、CD86）提示其主要具备免疫抑制或者诱导免疫耐受为主的功能。3.2负载供肾抗原的优势DC2体外抑制MLR的功能MLR实验表明，负载供体抗原的不成熟DC2对MLR均具有明显的抑制作用，与其他实验组和对照组之间有显著性差异（P0.05）。DC诱导移植免疫耐受的可能机制包括: 诱导调节性T淋巴细胞的产生，主要包括诱导CD4+ CD25+ T淋巴细胞的生成12-13，后者可能对移植免疫反应有抑制作用；诱导T淋巴细胞无能，清除或者凋亡诱导免疫偏移14-15,即诱导免疫反应从Th1型向Th2型转变。本实验的DC2细胞特异性抑制移植排此反应，其机理可能与诱导免疫偏离和其产生的细胞因子有关，与文献报道的DC2的功能也相符合 16-17。3.3负载供肾抗原的优势DC2防治大鼠肾移植急性排斥反应的体内实验观察在同种异体移植肾存活时间研究中以BN大鼠为供体， Lewis大鼠为受体，建立了大鼠肾移植急性排斥反应模型，从生存分析曲线中可知输注负载供肾抗原的优势DC2可明显能特异性地延长移植大鼠的远期存活时间，为DC2建立过继性和特异性免疫耐受预防急性排斥反应提供了直接有效的证据18。相对于负载无关抗原DC2组（303.95 天）、单纯DC2组（274.74 天）和空白对照组比较，虽然这两者也可以延长大鼠肾脏移植的存活。综上所述，体外培养诱导出大鼠不成熟淋巴系DC（DC2），进行同种异基因大鼠肾移植，在肾移植前输入DC2细胞能显著减轻移植排此反应，在大鼠同种异基因肾脏移植的同时输注负载供肾抗原的优势DC2具有预防和抑制急性排斥反应的发生，达到免疫耐受的效果，可延长生存时间，提高远期存活率。本研究结果为人DC2细胞过继免疫诱导肾移植耐受的应用研究打下了坚实的基础，提供了有力的理论和实验依据。参考文献：1Gilliet, M. and Y.J. 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