EDMAN降解法实用教案

蛋白质测序蛋白质测序中文名称：蛋白质测序中文名称：蛋白质测序 英文名称：英文名称： protein sequencing protein sequencing 定义：测定蛋白质分子的氨基酸排定义：测定蛋白质分子的氨基酸排列顺序列顺序(shnx)(shnx)。目前自动化的蛋。目前自动化的蛋白质测序仪系从肽链的白质测序仪系从肽链的N N端测入。端测入。 第1页/共20页第一页，共21页。 当前，所谓蛋白质测序，主要指的是蛋白质的一级结构的测定。蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目、多肽链的氨基酸顺序(shnx)，它是蛋白质生物功能的基础。 蛋白质氨基酸顺序(shnx)的测定是蛋白质化学研究的基础。第2页/共20页第二页，共21页。测序要求测序要求(yoqi)1 1 样品必需纯（样品必需纯（97%97%以上）以上）2 2 知道蛋白质的分子量；知道蛋白质的分子量； 3 3 知道蛋白质由几个亚基组成知道蛋白质由几个亚基组成(z (z chn)chn)； 4 4 测定蛋白质的氨基酸组成测定蛋白质的氨基酸组成(z chn)(z chn)；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 5 5 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。量。第3页/共20页第三页，共21页。EdmanEdman降解（降解（EdmandegradationEdmandegradation）：是测定）：是测定蛋白质一级结构的方法，主要是从蛋白质或蛋白质一级结构的方法，主要是从蛋白质或多肽氨基末端进行分析。由埃德曼多肽氨基末端进行分析。由埃德曼（P PEdmanEdman）在上世纪）在上世纪5050年代所创立。分为年代所创立。分为耦合、切割耦合、切割(qig)(qig)、萃取、转化、鉴定等几、萃取、转化、鉴定等几个步骤。个步骤。第4页/共20页第四页，共21页。1.偶联1）.定义(dngy)： 是由两个有机化学单位(moiety)进行某种化学反应而得到一个有机分子的过程实验(shyn)过程第5页/共20页第五页，共21页。 2）.异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽(du ti)的N-端残基反应异硫氰酸苯脂异硫氰酸苯脂蛋白质或多肽蛋白质或多肽(du (du ti)ti)苯氨基(nj)硫甲酰肽(PTC-肽 ）具体操作： 在pH90的碱性环境下，将异硫氰酸苯酯(PhN=C=S，PITC)和蛋白质或多肽N端氨基酸偶合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；实验过程第6页/共20页第六页，共21页。2.环化裂解1）.定义 环化：分子中形成环状结构 裂解：裂解是指只通过热能将一种样品（主要指高分子化合物）转变成另外几种(j zhn)物质（主要指低分子化合物）的化学过程。实验(shyn)过程第7页/共20页第七页，共21页。2）.苯氨基硫甲酰衍生物硝基甲烷中与酸作用(zuyng)发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。苯氨基(nj)硫甲酰衍生物苯乙内酰硫脲衍生物剩余(shngy)完整肽链具体操作 以三氟乙酸(TFA)处理耦合后产物，将多肽或蛋白的N一端第一个肽键选择性的切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物实验过程第8页/共20页第八页，共21页。3.转化(zhunhu)1）.苯乙内酰硫脲衍生物转化(zhunhu)为苯乙内酰硫氨基酸苯乙内酰硫脲衍生物苯乙内酰硫氨基酸具体操作： 萃取(cuq)出释放的氨基酸衍生物并在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH氨基酸)实验过程第9页/共20页第九页，共21页。异硫氰酸苯酯与所有氨基酸残基的反应产率和回收率都相当(xingdng)高，因此反应副产物少，用色谱可以准确鉴定。 Edman Edman降解降解(jin ji)(jin ji)法的优点法的优点对大多数氨基酸残基而言，30 min的耦合反应时间、5 min的切割(qig)反应时间都已足够。剩下的肽链仍是完整的，可依照此法重复测定新生的N末端氨基酸第10页/共20页第十页，共21页。应用应用(yngyng)(yngyng)：全自动蛋白质/多肽(du ti)N末端氨基酸序列分析仪第11页/共20页第十一页，共21页。应用(yngyng)：全自动蛋白质测序仪四个主要(zhyo)部件蛋白质测序仪主机微梯度运送系统紫外检测器型数据分析软件第12页/共20页第十二页，共21页。应用应用(yngyng)(yngyng)：全自动蛋白质测：全自动蛋白质测序仪序仪如需要(xyo)，脱盐处理或样品浓缩NEXT第13页/共20页第十三页，共21页。应用(yngyng)：全自动蛋白质测序仪偶联偶联以气态以气态(qti)(qti)形式输送形式输送12%12%三甲基胺水溶液（维持碱性环境三甲基胺水溶液（维持碱性环境等）等）输送输送(sh sn)5 PITC (sh sn)5 PITC （异硫氰酸苯脂）正庚烷溶液（异硫氰酸苯脂）正庚烷溶液重复碱的输送重复碱的输送(sh sn)(sh sn)45484548C C反应、惰性气体流干燥反应、惰性气体流干燥正庚烷和乙酸乙酯重复洗涤正庚烷和乙酸乙酯重复洗涤NEXT第14页/共20页第十四页，共21页。应用应用(yngyng)(yngyng)：全自动蛋白质：全自动蛋白质测序仪测序仪裂解裂解(li (li ji)ji)输送(sh sn)几微升无水三氟乙酸(TFA)4548C反应惰性气体流干燥除酸ATZ 氨基酸丁基氯溶液输送人转化器重复丁基氯抽提输送丁基氯以溶解释放的苯胺唑啉酮(ATZ 氨基酸)NEXT第15页/共20页第十五页，共21页。应用(yngyng)：全自动蛋白质测序仪转化转化(zhunhu(zhunhu)输送25 %-40%无水三氟乙酸水溶液(转化(zhunhu)介质R4)至转化(zhunhu)器45 50C 转化10 20 分钟PTH 氨基酸溶解于一种合适的溶剂混合物(S4)(如20 %乙腈水溶液含或不含乙酸钠添加剂以调节pH) 这样可直接注入在线HPLC 系统的HPLC 上柱NEXT第16页/共20页第十六页，共21页。应用(yngyng)：全自动蛋白质测序仪结果结果(ji (ji gu)gu)分析分析运行(ynxng)PTH-氨基酸并校准将每个循环切割下来的氨基酸于PTH-氨基酸进行比较并与前后循环的氨基酸进行比较确定N-末端氨基酸序列运行空白循环END第17页/共20页第十七页，共21页。应用(yngyng)：全自动蛋白质测序仪第18页/共20页第十八页，共21页。THANKS第19页/共20页第十九页，共21页。感谢您的欣赏(xnshng)！第20页/共20页第二十页，共21页。NoImage内容(nirng)总结蛋白质测序。1 样品必需纯（97%以上）2 知道蛋白质的分子量。Edman降解（Edmandegradation）：是测定蛋白质一级结构的方法，主要是从蛋白质或多肽氨基末端进行分析。分为耦合、切割、萃取、转化(zhunhu)、鉴定等几个步骤。2）.苯氨基硫甲酰衍生物硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。1）.苯乙内酰硫脲衍生物转化(zhunhu)为苯乙内酰硫氨基酸。第19页/共20页。感谢您的欣赏第二十一页，共21页。