SDS-PAGE电泳实验步骤

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目的学习 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 法 (SDS PAGE)测定蛋白质的分子量的 原理和基本操作技术。二、实验原理蛋白质是两性电解质，在一定的pH 条件下解离而带电荷。当溶液的质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。pH 大于蛋白pH 小于蛋聚丙烯酰胺凝胶 是由一 定量 的丙烯 酰胺和 双丙 烯酰胺 聚合而 成的 三维网 状孔结构。本实验 采 用 不连 续凝 胶系 统，调 整双 丙烯 酰胺用 量的 多少 ，可制 成不 同孔 径的两 层凝 胶；这 样， 当含有 不同分 子量 的蛋白 质溶 液通过 这两 层凝胶 时，受 阻滞 的程度 不同 而表现 出不 同的迁 移率。 由于 上层胶 的孔 径较大 ，不 同大小 的蛋白 质分 子在通 过大 孔胶时 ，受 到的阻 滞基本 相同 ，因此 以相 同的速 率移 动；当 进入小 孔胶 时，分 子量 大的蛋 白质 移动速 度减慢 ，因 而在两 层凝 胶的界 面处 ，样品 被压缩 成很 窄的区 带。 这就是 常说 的浓缩 效应和 分子 筛效应 。同 时，在 制备 上层胶 ( 浓 缩胶 ) 和 下层胶 ( 分离胶 ) 时 ，采 用两种 缓冲 体系； 上层胶 pH=6.7 6.8 ， 下层胶 pH 8.9 ； Tris HCI 缓冲液 中的 Tris 用 于维持 溶液的 电中性 及 pH，是缓 冲配对 离子； CI - 是 前导离 子。在 pH6.8 时 ，缓冲 液中的 Gly - 为尾 随离子 ，而在 pH 8.9 时， Gly 的解 离度增 加；这 样浓缩 胶和分 离胶之 间 pH 的不 连续 性，控 制了慢 离子的 解离度 ，进而 达到控 制其 有效迁 移率 之目的 。不同 蛋白 质具有 不同 的等电 点， 在进入 分离胶 后， 各种蛋 白质 由于所 带的 静电荷 不同， 而有 不同的 迁移 率。由 于在 聚丙烯 酰胺凝 胶电 泳中存 在的 浓缩效 应， 分子筛 效应及 电荷 效应， 使不 同的蛋 白质 在同一 电场中 达到 有效的 分离。如果在 聚丙烯 酰胺凝 胶中加 入一定 浓度的 十二 烷基硫 酸钠 (SDS) ，由于 SDS 带有 大量 的负电 荷， 且这种 阴离子 表面 活性剂 能使 蛋白质 变性 ，特别 是在强 还原 剂如巯 基乙 醇存在 下， 蛋白质 分子内 的二 硫键被 还原 ，肽链 完全 伸展， 使蛋白 质分 子与 SDS 充 分结合 ，形成 带负电 性的蛋 白质 SDS复合物 ；此时 ，蛋白 质分子 上所带 的负电 荷量远 远超过 蛋白质 分子原 有的电 荷量 ，掩盖 了不同 蛋白质 间所带 电荷上 的差异 。蛋 白质 分子量 愈小 ，在电 场中移 动得 愈快； 反之 ，愈慢 。蛋 白质的 分子量 与电 泳迁移 率之间 的关系 是：Mr =K(10 -b m)logM r =LogK b Rm，式 中Mr 蛋白质 的分子 量；logK 截距；b 斜率；Rm 相 对迁移 率。实 验证明 ，蛋白 质分子 量在15,000 200,000的范 围内， 电泳迁 移率与 分子量的 对数之 间呈线 性关系。 蛋白质 的相对 迁移率 Rm蛋白 质样品 的迁移 距离 染料 ( 溴酚 蓝 ) 迁移距 离。这 样，在 同一电 场中 进行电 泳，把 标准蛋 白质的 相对迁 移率与 相应的 蛋白 质分子 量对 数作图 ，由未 知蛋 白的相 对迁 移率可 从标 准曲线 上求出 它的 分子量 。SDS-聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳 (SDS-PAGE) 法测定 蛋白 质的分 子量具 有简便、快速、重复 性好的 优点， 是目前 一般实 验室常 用的测 定蛋白 质分 子量的 方法。三、试剂及主要器材1 主 要试剂1) 标准蛋 白混合 液内含：兔磷酸化酶 B(Mw 97,400) ，牛血清蛋白 (Mw 66,200) ，兔肌动蛋白 (Mw 43,000) ，牛磷酸酐 酶 (Mw 31,000) 和 鸡蛋 清 溶菌 酶 (Mw 14,400)2)30 凝 胶 贮备 液 ： 丙 烯 酰胺 （ Acr ）29.2g ， 亚 甲 基 双丙 烯 酰 胺 （ Bis ） 0.8g,加 双 蒸水 至 100mL。外 包锡 纸 ， 4冰箱保存， 30 天内使用。3)分 离胶 缓 冲液 (1.5mol L): Tris 18.17g,加 双蒸 水溶 解 ,6mol/L HCl调 pH8.8,定 容 100mL。 4冰箱保存4)浓 缩胶 缓 冲液 (0.5mol L): Tris 6.06g,加 水溶 解 ， 6mol/L HCl调 pH6.8 ， 并定 容 到 100mL。 4冰箱保存5)电 极缓 冲 液 (pH8.3) ： SDS lg ， Tris3g， Gly 14.4g ，加双蒸水溶解并定容到 1000mL。4冰箱保存。6)10 SDS，室 温 保存7)质量浓度 10过硫酸铵(新鲜配制)8)上 样缓 冲 液： 0.5mol L Tris-HCl pH6.81.25mL ， 甘 油 2mL， 10 SDS 2mL ， - 巯 基乙 醇 1mL， 0.1 溴 酚 蓝 0.5mL ， 加蒸 馏 水定 溶至 10mL。9)0.25 考 马斯 亮蓝 R-250 染 色液 ： 0.25g考 马斯 亮 蓝 R250 ，加 入 91ml50% 甲 醇 ，9ml 冰 醋 酸10) 脱 色 液 ： 50ml 甲 醇 ， 75ml 冰 醋 酸 与 875ml 双 蒸 水 混 合11) 未知 分子 量的 蛋白质 样品 (1mg mL )2 实验 器材1) DYCZ-24D 垂 直板 电泳 槽 ( 北京 市六 一仪 器厂 )2) 电 泳仪3) 长滴管及微量加样器4)烧 杯 (250mL 、 500m1) 、 量筒 (500mL 、250m1) 、 培 养 皿 (15cml5cm)5) 注射器等四、实验操作1装板将 密封 用硅 胶框 放在 平玻 璃上，然后 将凹 型玻璃 与平 玻璃 重叠，将两 块玻 璃立起 来使 底端 接触 桌面 ，用手 将两 块玻 璃夹住 放入 电泳 槽内 ，然后 插入 斜插 板到 适中程度, 即可灌胶。2 凝胶的聚合分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置10的分离胶和4.8 的浓缩胶。试剂名称10%的分离胶5%的浓缩胶Acr/Bis 30%/ml3.30.8分离胶缓冲液（ pH8.9 ） /ml3.750浓缩胶缓冲液（ pH6.8 ）01.2510%SDS/ml0.10.110%过硫酸铵 /ul5025双蒸水 /ml4.052.92TEMED/ul55按上表各液加入混匀后配制成分离胶后，将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓用滴管滴入，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿2cm 处为止 , 约 5mL。然后用细滴管或注射器仔细注入少量水, 约 0.5-1mL 。 室温放置聚合30-40min 。待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。用长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模子( 梳子 ) ；待浓 缩胶聚合后，小心拔出样品模子。3蛋白质样品的处理若标准 蛋白质或欲分离的蛋白质样品是固体，称取lmg 的样品溶解于lmL 0.5mol L pH6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中；若样品是液体，要测定蛋白质浓度，按 1.0 1.5mg mL溶液比例，取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀。 本 实验所用样品为15 20g 的标准蛋白样品溶液，放置在0.5mL 的离 心管中， 加入 15 20 l 的样品处理液。在 100 水浴中处理2min ，冷却至室温后备用。吸取未 知分子量的蛋白质样品20l ，按照标准蛋白的处理方法进行处理。4 加样SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法用手夹住两块 玻璃板, 上提斜插板 使其松开 , 然后取下玻璃 胶室去掉密 封用硅胶框 , 注意在 上述 过程中 手始 终给玻 璃胶室 一个 夹紧力 , 再将玻 璃胶 室凹面 朝里 置入电泳槽,插入斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上,外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处 即可 , 注意避免在电泳槽内出现气泡。加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以准确定位加样位置，或用微量注 射器依 次在各 样品槽 内加样 ，各加 10 15 l( 含 蛋白质 10 15 g) ， 稀溶液 可加 20 30 l ( 还要 根据胶 的厚度 灵活掌 握 ) 。5电 泳加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电流控制在 15 20mA，大约 15 20min ；样品 中的溴 酚蓝指 示剂到 达分离 胶之后 ，电流 升到 30 45mA，电泳 过程保 持电流 稳定 。当溴 酚蓝指 示剂迁 移到距 前沿 1 2cm 处即 停止电 泳，约 1-2 小 时。如 室温高 ，打开 电泳槽 循环水 ，降 低电泳 温度。6染 色、脱 色电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻 撬动 ，即将 胶面 与一块 玻璃板 分开 ，然后 轻轻 将胶片 托起 ，指示 剂区带 中心 插入铜 丝作为 标志，放入大培养皿 中染色 ，使用0.25 的考马 斯亮蓝 染液，染色2 4h，必 要时可 过夜。弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常 换脱色 液，直 至蛋白 质带清 晰为止 。7结 果处理1) 测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离(即蛋白质带中心到加样孔的 距离 ) ，测 量指示 染料迁 移的距 离。2) 按以下 公式计 算蛋白 质样品 的相对 迁移率 (Rm)相 对迁移 率样 品迁移 距离 (cm) 染 料迁移 距离 (cm)3) 标准 曲线的 制作 ：以各 标准蛋 白质 相对迁 移率 为横坐 标， 蛋白质 分子量 的对 数为纵 坐标在 半对数 坐标纸 上做图 ，得到 一条标 准曲线 。4) 测定 蛋白质 样品 的分子 量：根 据待 测蛋白 质样 品的相 对迁 移率， 从标准 曲线 上查得 该蛋白 质的分 子量。五、思考题1 聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳的几个不连续性是什么？2 电泳时的三个物理效应是什么？是怎样造成的？3 电泳后上下槽缓冲液可否混合后再使用？为什么？4 上样缓冲液中加入甘油 的作用是什么？5 贮液配制及贮存应注意什么？6过硫酸铵、 7%乙酸和考 马 斯亮 蓝 在实验中有什么作用？附：不同分离胶的配制方法分离胶的浓度20%15%12%10%7.5%双蒸水 /ml0.752.353.354.054.851.5mol/L2.52.52.52.52.5Tris-Hcl(pH8.8)/ml10%SDS/ml0.10.10.10.10.1凝胶储备液6.65.04.03.32.5（ Acr/Bis ）/ml10%过硫酸铵 /ul5050505050TEMED/ul55555总体积 /ml1010101010