兽疫链球菌的改良和发酵生产透明质酸

. . . . 学号：08109117 常 州 大 学硕 士 学 位 论 文兽疫链球菌的改良与其发酵生产透明质酸ImprovedStreptococcusZooepidemicus For Producing Hyaluronic Acid By FermentationA Dissertation Submitted toChangzhouUniversityBySunXiao-HuiOrganic ChemistryDissertation Supervisor:Prof. Wang Li-QunMarch，201164 / 77大学学位论文原创性声明本人重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作与取得的研究成果。除文中已经注明引用的容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人已完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：签字日期：年月日学位论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分容，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。论文注释：本学位论文属于围，在年解密后适用本授权书。非论文注释：本学位论文不属于围，适用本授权书。学位论文作者签名：签字日期：年月日导师签名： 签字日期：年月日学位论文原创性声明本人重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名： 日期： 年 月 日学位论文使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大学可以将本学位论文的全部或部分容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。涉密论文按学校规定处理。作者签名：日期： 年 月 日导师签名： 日期： 年 月 日中 文 摘 要透明质酸(hyaluronic acid, HA)是由(-1,4)-D-葡糖醛酸-(-1,3)-N-乙酰-D-氨基葡糖的双糖单位重复连接组成的高分子链状聚合物。HA因其特殊的生物功能学、独特的流体力学特性和极强的持水保湿性，广泛应用于医药、化妆品、食品等领域。本研究旨在筛选HA产生菌株，通过多种诱变育种的方法提高透明质酸的产量，并建立发酵液透明质酸含量的快速检测方法，对改良后菌种的培养条件进行优化，最后对菌种的透明质酸合成酶基因进行克隆和序列分析，为通过基因工程技术手段提高菌种HA产量打下基础。从160份牛鼻粘膜中成功筛选到一株野生型产透明质酸菌株。样品经梯度稀释后涂布血琼脂平板，观察菌落的形态特征和溶血特征，筛选到一株有荚膜的乙型溶血链球菌。将该菌株的发酵液多糖精提物和HA标准样的红外谱图进行对比，特征吸收峰的位置和形状基本一样，峰的相对强度相似，说明该菌株为产HA菌株。对透明质酸含量检测方法CTAB比浊法和Bitter-Muir法进行优化和比较，并用于发酵液中透明质酸含量的检测，成功建立了一种更快速、更精确、更准确、更高效的透明质酸检测方法。线性回归方程为y=0.0071x-0.1018， R=0.99987。以筛选到的菌株为出发菌株，经过紫外诱变得到溶血突变型菌株UV1。以突变菌株作为出发菌株进行NTG、微波复合诱变，筛选出一株HA产量明显提高的菌株W2，产量达到1.446 g/L，并且遗传稳定性优良。对突变菌株的摇瓶发酵条件进行了初步优化，确定了最佳发酵条件为：温度35 ，初始pH值8.0，装液量50 mL / 250 mL，转速180 r/min，发酵时间20 h时，HA产量达到1.86 g/L，比初始条件下提高了29%。在发酵过程中添加脯氨酸和葡萄糖酸钠可以提高HA产量，发酵10 h时添加1 g/L的脯氨酸，HA的产量提高至1.986 g/L；发酵12 h时加入12.5 g/L葡萄糖酸钠作为补充碳源，HA的产量提高至2.267 g/L。从筛选到的产透明质酸原始菌株中获得其基因组DNA，以此为模板通过PCR扩增获得透明质酸合酶基因has A序列，用限制性切酶EcoR I和BamH I对目的基因和质粒pET-22b进行双酶切，然后将目的基因与质粒pET-22b进行连接，转入E.coliDH5，得到转化子pET-22b-hasA，对转化子插入片段进行核酸序列分析，并与基因库中has A基因序列进行比对，为进一步通过基因工程手段改良菌种打下了良好的基础。关键词：透明质酸；筛选；诱变；发酵；基因工程ABSTRACTHyaluronic acid is a linear macromolecular polymer which is comprised of alternated disaccharide units of D-glucuronic acid and N-acetyl glucosamine by-1,3 and-1, 4 glycosidic bonds. Depending on its special physiological characters, unique hydromechanical properties and excellent ability of holding water, HA is widelyused in the fields ofpharmacy, cosmetics and food etc.The purpose of this study was toscreen HA- producing strain, to enhance the yield of HA through mutation breeding, to establish a rapidmethod to analyze the concentration of hyaluronic acid in fermentation broth,to optimize the fermentation conditionsof improved strain,and to clone and analyze the hyaluronidase A gene (hasA) sequence which is helpful to improve HA yeild by genetic engineering.One strain of hyaluronic acid-producing bacteria was islolated successfully from 160 collected cattle tunica mucosa samples. Samples were coated on blood agar flat platesafter gradient dilution, a strain of -hemolytic streptococcus with capsule was identifiedby observation of morphplogical and hemolytic properties of colonies on the plates.The infrared spectroscopy of hyaluronic acid standard and fermentation broth extract of the screened bacteriumwas compared, and the size, shape and relative intensity of their typical IRpeaks are similar. These results demonstrated that the -hemolytic streptococcusproduces HA.The Bitter-Muir method and CTAB turbidimetric method were optimized to measure the concentration of hyaluronic acid in fermentation broth. The results showed that CTAB method is superior to Bitter-Muir method in terms of accuracy, precission and efficiency. The regression equation is y=0.0071x-0.1018, R=0.99987.Using the screened bacteria as original strain, a hemolysin deficient mutant named UV1 was obtained by ultraviolet irradiation. UV1 wasmutatedsubsequently by the combination of NTG treatment and microwave irradiation. A mutant named W2 with higherproduction capacity of hyaluronic acid was selected from all mutants by analyzing the HA concentration in fermentation broth. The yield of HA was stable after transferring five generations and reached to 1.446g/L. Its fermentation conditionsin shaking flaskwere optimized primarily. Under the conditions of 35, pH8.0, 50mL fermentation medium in 250mL flask, stiring speed 180 rpm and the fermentation time 20 h,the yield of HA reached to 1.86g/L. Compared to the original conditions, the yield was increased by 29%. The adding of proline and sodium gluconate during the fermentation process could ehance the HA yield. The HA yield could reach 1.986g/L throughthe addition of1g/L proline by the time of 10 h fermentation, and could reach 2.267g/L through adding12.5g/L sodium gluconate as a carbon source complement by the time of 12 h fermentation.The genome DNA was extracted from the original strain, and the gene has A was obtained by PCR. The restriction enzymesBamH Iand EcoRIwere selected to digest the aimed gene DNA sequence and the vector pET-22b. Then the hasA genewas inserted into the vector pET-22b, and the recombinant plasmid pET-22b-hasA was transformed into E.coli DH5. The sequence of insert fragment was analizedand compared with otherhasA gene sequences in gene bank.The results provided a good basis for further improving strains by genetic engineering.KEYWORDS:Hyaluronic acid; Screening; Mutagenesis; Fermentation ; Genetic engineering 目 录1 绪论11.1 透明质酸的理化性质11.2 透明质酸的分布与生理功能11.2.1 透明质酸的分布11.2.2 透明质酸生理功能21.3 透明酸的应用21.3.1在化妆品中的应用21.3.2 在医学方面的应用31.4 透明质酸生产现状31.4.1 获得高产菌株41.4.2 培养基与发酵条件优化51.4.3 发酵液中透明质酸含量检测方法51.4.4 透明质酸的提取61.5 课题研究容和目的61.5.1 本课题研究容61.5.2 本课题主要目的72 透明质酸产生菌的分离、筛选与初步鉴定82.1 实验材料82.1.1 采样82.1.2 主要培养基与溶液组成82.2 实验方法92.2.1 透明质酸的分离纯化92.2.2 菌种的筛选102.2.3 菌种的初步鉴定102.3 实验结果与讨论112.3.1 菌种的筛选112.3.2 菌种的分类鉴定132.4 本章小结133 透明质酸含量检测方法建立143.1 实验材料143.1.1 主要仪器143.1.2 主要试剂143.2 实验方法153.2.1 透明质酸的初步纯化153.2.2 CTAB比浊法153.2.3 改良Bitter-Muir法153.3 结果与讨论153.3.1 CTAB比浊法153.3.2 Bitter-Muir法203.3.3 两种方法准确性比较223.3.4 两种方法精确性比较223.3.5 两种方法直接测定发酵液中HA含量的比较233.4 本章小结234 透明质酸高产菌的诱变选育244.1 实验材料244.1.1 菌种244.1.2 主要培养基与溶液244.1.3 主要仪器254.2 实验方法254.2.1 LiCl处理254.2.2 紫外诱变254.2.3 NTG诱变254.2.4 微波诱变264.2.5 紫外+NTG诱变264.2.6 紫外+NTG+微波诱变264.2.7 中间培养264.2.8 稀释涂板264.2.9 突变菌株筛选274.3.10 分析方法274.3 结果与讨论274.3.1 紫外诱变最佳时间的选择274.3.2 NTG诱变最佳条件284.3.3 微波诱变最佳条件选择304.3.4 诱变结果分析304.4 本章小结335 透明质酸发酵法生产工艺条件的初步研究355.1 实验材料355.1.1 菌种355.1.2 培养基355.2 实验方法365.2.1 发酵条件的优化365.2.2 添加剂对发酵的影响375.3 结果与讨论375.3.1 发酵条件优化结果375.3.2 添加剂的影响405.4 本章小结426 透明质酸合成酶基因克隆与载体构建初步研究436.1.1 菌株、质粒436.1.2培养基436.1.3 酶、化学试剂446.1.4主要实验试剂配方446.1.5 PCR扩增用引物446.2 实验方法456.2.1 提取兽疫链球菌总DNA456.2.2 目的基因的PCR扩增456.2.3 PCR扩增DNA片段的回收纯化466.2.4感受态细胞的制备466.2.5 质粒DNA（PET-22b）的提取与检测476.2.6目的基因片段和质粒的双酶切476.2.7 双酶切产物回收476.2.8 双酶切后的目的基因和质粒连接486.2.9 重组质粒PET-22b导入E.coli DH5感受态细胞486.2.10 重组质粒的提取486.3 结果与讨论486.3.1 基因组总DNA提取结果486.3.2 hasA片段的PCR扩增496.3.3质粒DNA（PET-22b）的提取结果506.3.4 hasA基因和PET-22b双酶切电泳检测516.3.5 重组质粒的表达516.3.6 转化子的测序验证526.4 本章小结537 结论与展望54参考文献56攻读硕士学位期间研究成果60致611 绪论透明质酸（Hyaluronic acid，简称HA），是一种高分子量的直链酸性粘多糖1。1934年，美国Meyer 和Palmer2首次从牛眼玻璃体中分离提取到透明质酸，它是由(-1,4)-D-葡糖醛酸-(-1,3)-N-乙酰-D-氨基葡糖的双糖单位重复连接组成的高分子链状聚合物3,4。透明质酸可以吸收并保持自身重量几千倍的水分，是保水性最好的天然物质。透明质酸主要分布在动物和人体组织的细胞外基质中，对细胞的稳定和运动、增殖、分化以与组织的表现型等都有重要作用。透明质酸存在于结缔组织中，可以满足很多重要功能，如韧性、支持结构以与细胞的代调节。作为一种可吸收，可降解的生物材料，HA因其高度的黏弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性，在医药、化妆品、食品领域中广泛应用5。我国每年透明质酸的需求量很大，但产量较低，供需缺口很大，其在国外市场是一种紧俏产品，市场前景非常广阔。1.1 透明质酸的理化性质HA 具有许多天然粘多糖共有的性质，有强吸水性，易溶于水而不溶于有机溶剂。在氯化钠溶液中会产生氢离子（葡萄糖醛酸中的-COOH解离），从而赋予了HA酸性粘多糖的性质。透明质酸的相对分子质量约为106，分子中含有200l0000个双糖。电子显微镜下观察HA呈线性单链状，在水溶液中会扩展为随机的线圈状其直径约为500 nm。由于直链轴上单糖之间氢键相互作用，HA分子在空间上呈刚性的螺旋柱型，柱侧因有大量羟基而产生强亲水性6。因螺旋空间外侧具有疏水性使这些水在螺旋柱相对固定，不易流失。HA由于其大分子链的柔顺性而具有较强的成膜能力，可以形成一层保水薄膜。HA水溶液是一种非牛顿型流体，有独特的粘弹性和应变性7。Gibbs8等发现，低浓度的HA溶液主要体现为粘性，而高浓度溶液主要体现其弹性。1.2 透明质酸的分布与生理功能1.2.1 透明质酸的分布HA广泛存在于人和动物的各种组织间质中，如皮肤、脐带、眼玻璃体、鸡冠、关节滑液等。HA也是链球菌和绿脓杆菌等菌株荚膜的主要成份。不同组织获得的HA分子量可能不同，但它们之间无种属差异并且对人与动物无抗原性。1.2.2 透明质酸生理功能HA是构成细胞外基质（ECM）和细胞间质（ICM）的主要成分9。HA分子中的羧基和其他极性基团可以与水形成氢键而结合大量水分，可吸收和保持其自身重量上千倍的水分，有“天然保湿因子”(NMF)的美称。HA是天然存在于人体皮肤中的具保水功能的聚合物，具有较高的理论保水值10。 HA的亲水作用使组织有一定的渗透压，从而维持组织的正常状态。HA作为药物载体11，具有缓释药物作用和促进药物透皮吸收功能。溶液中HA分子交联形成的网状结构能够粘附药物分子，减缓药物在体扩散速度，产生长效、延效作用。HA具有促进创面伤口的愈合12的作用，低分子量的HA可以促进血管生成，高分子量的HA可以抗炎并调节炎性细胞，进而促进伤口愈合。小分子量的HA具有抑制病菌生长、抑制病原反应的功能，产生抗菌消炎作用。而大分子量的HA由于其成膜能力可以在皮肤表面形成一层水化膜，将皮肤与细菌隔离开，阻止细菌侵入皮肤，间接产生抗菌消炎作用。HA对细胞具有多种作用13,14如保护细胞并对细胞的吞噬功能有一定影响，同时可以屏蔽细胞膜上的机械感受器，影响细胞移动、增殖和分化等。1.3 透明酸的应用透明质酸因其具有特殊的生理功能、独特的流变力学特性以与优良的保湿能力，在化妆品工业、医学临床研究、食品美容保健品行业等领域有着广泛的应用。不同分子量的透明质酸有着不同的用途，中等分子量的HA主要应用于化妆品，而高分子量的HA可用于眼科粘性手术、治疗关节病、软组织修复和作为药物载体，特别是在预防和减少外科手术后组织粘连中具有很高的应用价值。1.3.1 在化妆品中的应用水是生命的源泉，是构成生物机体的重要物质，如果没有水，任何生命过程都无法进行。衰老的身体会逐渐失去水分，而人体组织保持水分最重要的物质就是透明质酸，它与蛋白质的水合作用让人体组织保持大量水分。当在皮肤表面涂上含有HA的化妆品时，HA能快速形成一层具有粘弹性的水化膜，主要作用是保持皮肤水分并润湿角质层，对促进皮肤吸收护肤品中其它活性营养成分有良好的作用，从而保持皮肤年轻延缓衰老15。透明质酸的天然保湿特性，使其成为化妆品中不可缺少的重要保湿成分16。中的紫外线会使皮肤变红、变黑、脱皮等，含透明质酸的护肤品可以通过促进表皮细胞的增殖和分化，清除自由基的作用，可促进受太阳灼伤部位皮肤的再生17。1.3.2 在医学方面的应用作为一种天然降解且具吸收性的生物医学材料，透明质酸在医学的各个领域用途非常广泛。透明质酸含量在很多疾病中会出现明显的升高，可以作为诊断一些疾病的指标。血清中透明质酸含量水平与肝脏疾病以与肝细胞损害程度呈密切相关18。HA广泛应用于眼科、鼻科、喉科、骨科和普外科等方面19。HA稀溶液可用于治疗干性角膜炎综合症20,21，因其具有铺展湿润能力，对眼球起润滑和保护作用。HA制剂可有效治疗鼻鼾和嗓音嘶哑22。在外科手术中HA具有术后防粘连的作用，另外，还可用于耳鼓膜修补手术。HA是关节润滑和关节软骨基质的重要成分，可用于骨关节炎、肩周炎、类风湿关节炎的治疗23。HA作为一种药物载体，可将各种药物导向各病理部位并定位释放。并且可以添加透明质酸酶抑制剂，通过抑制透明质酸酶的活性而使HA不被分解，达到缓释控释的作用，从而维持正常的生理功能24。江德臣25等根据HA的电敏特性，设计了一种免疫传感器，在一定的离子强度和酸性围有较好的生物稳定性，有应用于临床医学的可能。1.4 透明质酸生产现状目前国外常用的制备透明质酸的方法是动物组织提取法和微生物发酵法生产HA。还有一些其它方法，比如，酶聚人工合成法、动物胎细胞分离法、蛋壳膜提取法26等。国现有的透明质酸生产厂家大都是用动物组织提取法，其工艺过程为脱水、磨碎、浸泡、提取、除杂、沉淀和分离。动物组织提取法工艺流程简单，但动物组织来源有限，且原料中HA含量低，产品收率低，提纯难，成本过高，产品质量差，难以用于大规模生产27。为了满足HA日益增长的市场需求，必须寻找HA的新来源，降低生产成本，这就促进了微生物发酵法生产HA的研究。发酵法生产HA生产成本低，产品的分子量和质量高，可工业化生产规模不受动物组织原料限制。发酵液中HA以游离状态存在，易于分离纯化，提纯效率高。HA产品无动物来源的致病菌污染的危险，增强了市场竞争力。发酵法生产HA的质量主要取决于三个方面：高产菌株的筛选，培养基成分与发酵条件优化，高效的分离提纯工艺28。1.4.1 获得高产菌株1.4.1.1 诱变育种诱变的目的是为了获得HA产量高、优良性状稳定的菌株29。野生型的链球菌作为HA产生菌，首先要经过诱变使其成为溶血素和透明质酸分解酶双缺陷型菌株。链球菌基本都会产生溶血素，溶血素能溶解红细胞并杀死白细胞，对心脏也有一定的毒害。目前报道的用作产HA菌株的诱变剂主要有紫外线，射线，NTG等30，为了使菌株稳定，不易发生回复突变，诱变剂应使遗传物质发生较大变化。Kim31等人用NTG诱变兽疫链球菌得到高产菌株，发酵产量为6 g/L-7 g/L。邓开野32筛选出一株溶血缺陷型的突变菌株，产量也比原始出发菌株有很大提高。野生型产HA的链球菌在代分泌透明质酸的同时还会产生透明质酸分解酶，而透明质酸分解酶会将HA降解，或者降低透明质酸的分子量，因此在发酵生产HA过程中应去除透明质酸分解酶的影响。甲乾33利用重离子和紫外线相结合诱变筛选出溶血性和透明质酸酶双缺陷型变异菌株。1.4.1.2 构建工程菌传统的诱变存在诱变率低，工作量大，对产量和分子量提高有限，或者不能兼顾的缺点。目前国外从传统的诱变育种到定向更为准确的原生质体融合34和基因工程技术，实现构建HA产量更高的工程菌。构建工程菌的方法主要有DNA重组、转基因技术和原生质体融合等。基因工程菌是采用现代生物工程技术加工出来的菌株，具有多功能、高效、遗传性状稳定和适应性强等特点。在发酵过程中工程菌发挥着重要的功能，大大提高了发酵效率。郝宁35等运用基因诱变育种将vgb基因导入兽疫链球菌以促进细胞在低氧状态下生长，同时在兽疫链球菌中过表达HA合成酶基因，增加HA合成的前体，使HA产量增加31%。曲凯36通过兽疫链球菌中与透明质酸合成有关的基因进行研究，分析了透明质酸生物合成途径，并分离了相关基因，为基因工程方法改造兽疫链球菌，提高其透明质酸产量提供了理论依据。Weigel37-39等先后从S. equlsinilis和S. pyogenes中克隆了HA合成酶基因，并将此基因转入大肠杆菌等宿主细胞中，用来生产HA。目前用于工业化生产的产HA基因工程菌是诺维信公司使用的枯草杆菌，该工程菌含HA合成酶基因和UDP-葡萄糖脱氢酶基因，产量为6.5 g/L-7.5 g/L，处于国际领先水平。1.4.2 培养基与发酵条件优化链球菌对营养条件要求比较苛刻，HA发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐、维生素、生长因子和添加剂等40。一般碳源使用葡萄糖41，而敏杰42选择不同碳源进行发酵生产HA对比，结论是只有蔗糖不能被利用，高海军43等发现蔗糖仅比葡萄糖的利用率低。氮源不仅为菌体生长提供氮元素，很多有机氮源还能为微生物提供生长因子，从而促进其生长代。在氮源的选择上，培养基中添加复配的氮源比单一氮源效果更好，因为复配的氮源能提供不同生长因子进行互补，利于细胞生长。菌株不同，其最适的培养基也可能不一样，需要根据实验而定，但也要结合考虑成本与工业化等问题来选择培养基成分。发酵条件是影响HA产量和相对分子质量的关键因素，适宜的发酵条件不仅有利于菌体的生长，而且可以提高微生物对底物的利用能力，使代向着有利于产物合成的方向进行。发酵条件主要包括温度、pH值、转速、发酵时间、添加剂和培养方式等。Armstrong44等发现，温度高于或低于37，HA的产量和相对分子质量都会下降。根据Michael45等人研究，pH为6.70.2时，HA产量最高。搅拌可以强化气-液间氧的传递，增加发酵液中的溶氧量，发酵过程中搅拌并不明显促进细菌的生长，但能提高HA的产量。Lin Long46等报道，通过分批培养和补料分批培养2种方式结合培养来提高HA的产量。发酵过程中，添加表面活性剂和溶菌酶分别可以提高HA的产量和相对分子质量。1.4.3发酵液中透明质酸含量检测方法目前，HA含量测定普遍采用硫酸咔唑法和CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）比浊法。随着对CTAB比浊法更多的探讨和探讨的不断深入，CTAB比浊法越来越显示了它独特的优势，并将逐步取代硫酸咔唑法。各自的实验步骤也随着人们对实验的不断深入和探索不断简化，测量的精确度和效率也大幅度提高。（1）CTAB比浊法早在1956年，Ferrante等就利用透明质酸和CTAB络合可生成复合物的性质，开发了CTAB比浊法测定溶液中透明质酸的含量。CTAB比浊法是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液与HA溶液反应产生混浊的特性，通过反应体系的吸光度来反映其浊度47-49，进而通过浊度与HA浓度的线性相关性，建立起一种快速、安全、准确地测定HA的方法。在溶液中，CTAB的氮原子可以与HA中羧基的氧原子配对，形成不溶于水的HA-CTAB络合物。而CTAB不会与生成HA的单体UDP-葡萄糖酸和UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖胺作用，从而保证了CTAB浊度法的准确性和可行性。该方法可以有效提高菌株筛选、发酵条件优化以与发酵生产中HA产量日常监测的工作效率。（2）硫酸咔唑法硫酸咔唑法是将硫酸咔唑液与HA溶液反应，是一种测定HA的通用方法，在实验中，人们通常将其作为一种基准来评定其他测量方法的准确性。在原先咔唑法的基础上不断改良，实验工作者的不断验证和努力造就了今日一套成熟的硫酸咔唑法测定方式。它首先要用强酸将HA裂解成单糖单位50，通过葡萄糖醛酸与咔唑发生显色反应，间接测定HA含量，对强酸的纯度和裂解条件要求较高，并且发酵液成分与杂质对其精度干扰很大。硫酸咔唑法前处理需要很长的时间，且对样品纯度要求较高，此法在CTAB比浊法未得到推广以前一直应用广泛。在实际测量中测得结果往往与实际情况不符，实验证明中性糖的存在对测定结果又较大影响，因而在测量中要消除发酵液中中性糖的影响是十分必要的。1.4.4 透明质酸的提取纯度和相对分子量的高低决定了HA产品国际市场中的竞争力，下游分离纯化工艺是获得高纯度、高分子量HA的关键环节51。由于含HA的发酵液粘稠度很高，不易将HA与菌体快速有效分离52，并且菌体发酵生产HA过程中所产生的透明质酸酶会降解HA，使HA分子量降低。故在进行HA产品分离纯化时首先要对发酵液进行适当的浓度稀释，尽快灭酶、灭菌、除菌等预处理53。分离工艺常用方法54有：乙醇分离，膜技术分离，壳聚糖分离。纯化工艺主要有：季铵盐纯化，酶解纯化，过滤法纯化，离子交换层析纯化，凝胶过滤柱层析纯化。发酵液中分离纯化HA一般是由多种分离纯化方法共同完成的，单一的分离纯化方法不能使HA产品达到很高的纯化程度，并且每种分离纯化方法也都存在一定的局限性55。因此，应根据发酵液的特性和分离纯化方法的特点找到合适的分离纯化工艺路线。1.5 课题研究容和目的1.5.1 本课题研究容（1）透明质酸产生菌的筛选鉴定和诱变选育。（2）优化CTAB比浊法，建立一种更快捷、更精确、更准确和更高效HA含量检测方法。（3）通过基因工程技术，对筛选到的菌株进行改造，获得更安全高效的工程菌株。（4）寻找透明质酸发酵的最优条件，研究添加剂对发酵生产HA的影响。1.5.2 本课题主要目的筛选并鉴定产透明质酸的菌株，利用物理方法和化学试剂诱变除去菌株的溶血性，对培养条件进行优化，降低菌株较为苛刻的营养要求，提高HA产量；对菌株的透明质酸合酶基因进行克隆和序列分析，对通过基因工程技术改造生产菌株进行必要的前期探索。2 透明质酸产生菌的分离、筛选与初步鉴定在微生物发酵生产透明质酸过程中，获得优良的菌种非常关键。目前报道的高产透明质酸菌株主要属于链球菌类，而牛鼻粘膜是链球菌较容易生长的地方。本实验采样于赣榆县养牛场中的牛鼻粘膜共160份，目的在于从中筛选到一株透明质酸产生菌，并对其进行初步鉴定。2.1 实验材料2.1.1采样赣榆县赣榆村养牛场牛鼻粘膜160份。2.1.2 主要培养基与溶液组成2.1.2.1 血琼脂培养基葡萄糖的质量分数2%，Tryptone 1%，MgSO47 H2O 0.1%，KH2PO40.2%，琼脂1.5-1.6%，pH值7.0，115灭菌20 min，冷却至40以下，无菌条件下加入无菌脱纤维羊血。2.1.2.2 摇瓶培养基葡萄糖的质量分数4%，Tryptone 1%，beef extract l%，MgSO47 H2O 0.1%，KH2PO40.2%，pH值7.0，115灭菌20 min，冷却至40以下，无菌条件下加体积分数10%的小牛血清。2.1.2.3 斜面培养基牛脑浸液800 mL，牛心浸液200 mL，beef extract 0.3%，Tryptone 1.25%，NaCl 0.5%，琼脂1.5-1.6%，pH 7.0，121灭菌20 min。2.1.2.4 种子培养基葡萄糖的质量分数1.25%，Tryptone 1.25%，Yeast extract 1.25%，NaH2PO4 0.04%，NaCl 0.2%，灭菌前pH 7.0，115灭菌20min。2.1.2.5吕氏美蓝染液A液：美蓝（Methylene blue，又名甲烯蓝）0.3g，95%乙醇30 mL。B液：0.1 g/L KOH溶液 100mL。混合A液和B液即成，用于细菌单染色，可长期保存。根据需要可配成稀释美蓝液，按1:10或1:100稀释均可。2.1.2.6革兰氏染色所用染液结晶紫(crystal violet)液：A结晶紫 2g 乙 醇 20mLB 草酸铵 0.5g 蒸馏水 80mL将A、B液相混合，放置24h后使用。此液比较稳定，可保存数月。碘液：取1 g碘片与2 g KI相混，加1-2mL蒸馏水研磨，然后可再加3-4mL蒸馏水研磨，直到碘片溶解为止。然后将此液用少量的蒸馏水洗入贮瓶，并补足到总量为100mL蒸馏水，即为碘液母液。此溶液稳定，可放置数月。使用时，取1份上述碘液加2份蒸馏水，即为革兰氏染色用碘液。95%乙醇：用于脱色。番红花红液：番红2.5g，95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。2.2 实验方法菌种的筛选流程：牛鼻黏膜 稀释涂平板 初筛菌株 纯种分离 复筛菌株 发酵液HA提取 定性分析 目的菌株 斜面培养 菌种鉴定 2.2.1 透明质酸的分离纯化2.2.1.1 透明质酸的粗提发酵液6000 rmp离心10 min取上清液加2.5倍体积无水乙醇，搅拌20 min，经多次乙醇分级沉淀后得到HA粗品。2.2.1.2 CTAB络合粗品溶于0.05 mol/L NaCl溶液中，加入体积分数10%的十六烷基三甲基溴化铵，搅拌30 min后静置1 h，6000 rpm离心10 min得到沉淀络合物。2.2.1.3 HA精提不同浓度的NaCl解离沉淀络合物，离心去除沉淀，上清液加入2.5倍体积乙醇沉淀，沉淀在五氧化二磷存在下常温真空干燥得HA精品。2.2.2 菌种的筛选2.2.2.1 采样棉签采集牛鼻粘膜160份，此处是链球菌容易生长的地方。2.2.2.2 初筛配制0.1%的蛋白胨溶液，用梯度稀释倍数法将牛鼻黏膜稀释成不同的浓度，涂布棒均匀涂布于血琼脂平板培养基，放入37恒温箱中培养24 h，观察菌落的溶血性和形态。2.2.2.3 分离纯化血琼脂平板上挑取溶血素缺陷型菌株，作为初筛疑似菌株进行划线分离，将血平板在37恒温箱中培养24 h。挑取单菌落进行美兰染色，显微镜观察，若菌落中有杂菌存在，则继续划线分离，再培养，直到染色后菌落单一无杂菌。2.2.2.4 复筛将初筛疑似菌株接入摇瓶培养基中，每株2瓶，120 rpm/min，37的摇床中空气振荡培养24 h，复筛发酵液进行HA精提，对得到的多糖精品红外吸收光谱定性分析。2.2.3 菌种的初步鉴定根据链球菌常用的鉴定方法，进行菌株的培养特征和生长特征观察。2.2.3.1 菌落培养特征纯化好的菌种，用接种环接种于血琼脂平板培养基中，37恒温培养箱中培养24 h，进行菌落形态和溶血性观察。2.2.3.2 菌种的镜检选择在基本培养基上生长的细菌，经染色后，在显微镜下测量菌体的大小，观察菌体的形状、排列方式或分枝的情况等，观察细菌的革兰氏反应，有无荚膜等。2.3 实验结果与讨论2.3.1 菌种的筛选2.3.1.1 初筛结果将采集的160份牛鼻黏膜样品用0.1%的蛋白胨溶液稀释成不同浓度后，分别涂于血琼脂平板培养基上，37恒温箱中培养24 h，在两块平板上分别发现3株明显溶血性菌种，从图2-1和2-2中可以看出平板2中的菌落周围形成3-4 mm宽、界限清晰、完全透明的溶血环，说明该菌株溶血性较强，而平板1中的菌落周围形成1-2 mm宽、不完全透明的溶血环。根据相关资料报导，HA产生菌一般分为乙型溶血性链球菌，甲型溶血性链球菌以与无溶血现象的丙型链球菌。初步推断平板1中菌落为乙型溶血，平板2中菌落为甲型溶血。图 2-1 乙型溶血菌落 图2-2 甲型溶血菌落Fig 2-1 -hemolytic streptococcus Fig 2-2 - hemolytic streptococcus2.2.1.2 复筛结果血琼脂平板上挑取溶血素缺陷型菌株，作为初筛疑似菌株进行划线分离，将血平板在37恒温箱中培养24 h。挑取单菌落进行美兰染色，显微镜观察，若菌落中有杂菌存在，则继续划线分离，再培养，直到染色后菌落单一无杂菌。3只250 mL锥形瓶，分别装入50 mL摇瓶培养基，并接入初筛疑似菌株，将锥形瓶放入37空气浴摇床中，摇床转速200 rpm/min，进行发酵培养24 h。采用HA精提法对发酵液进行分离提纯，用红外分光光度计对得到的多糖精提物产物进行定性分析。图2-3 HA标样红外吸收图谱Fig 2-3 Infrared absorption spectrum of HA standard sample图2-4HA精提物红外吸收图谱Fig 2-4 Infrared absorption spectrum of HA refined extracts从图2-4可以看出，发酵液多糖精提物的红外吸收图谱在3420 nm附近有强-OH伸缩振动的特征吸收峰，说明有多羟基结构；在2920 nm附近有-CH2的伸缩振动的特征吸收峰，1650和1560 nm处有-CO、-CN的伸缩振动的特征吸收，表明含有乙酰氨基结构；在1410、1310 nm处有-COC的伸缩振动和-OH的弯曲振动耦合产生的2个吸收峰，表明存在着有解离羧基结构和多糖羟基结构的糖醛酸。筛选菌株的发酵液精提物呈较典型的HA红外吸收图谱，可以确定该发酵液多糖精提物为透明质酸。根据以上分析，也可以进一步确定筛选得到的链球菌可以产生HA。2.3.2 菌种的分类鉴定2.3.2.1菌落培养特征观察菌落周围有透明的溶血圈，菌落直径1-2 mm，透明度很高，灰白色隆起，接种环挑起呈蛋清状黏连。2.3.2.2 菌种镜检结果细菌染色镜检，筛选菌株在固体平板培养基中培养时，培养物大部分为短链成对或聚集成丛的葡萄球菌，接种于液体培养基中培养时，培养物则基本呈长链状。革兰氏染色呈阳性，湿墨汁法荚膜染色后镜检，发现有明显荚膜。图2-5 革兰氏染色Fig 2-5 Gram stain2.4 本章小结从取自赣榆养牛场的牛鼻黏膜中成功筛选到一株透明质酸产生菌，根据菌落形态特征，溶血性，以与染色结果，初步鉴定为兽疫链球菌。通过摇瓶发酵培养，分离提取发酵液中的透明质酸，得到多糖粗品，红外光谱扫描显示此多糖为透明质酸。3 透明质酸含量检测方法建立高效快速地测定发酵液中HA的含量不仅能提高筛选透明质酸高产菌株的效率，而且对发酵条件的优化与工艺控制有非常重要的意义。目前最常用的测定发酵液中HA含量的方法是Bitter-Muir法，其原理是用强酸将HA裂解成单糖单位，通过葡糖醛酸与咔唑显色反应间接测定HA含量。最近有报道采用更简便的CTAB比浊法，其原理是HA在溶液中可与十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等阳离子表面活性剂发生络合反应，产生混浊现象，并在一定浓度围遵循朗伯-比尔定律。本实验对上述两种方法分别进行优化，并比较二者用于检测发酵液中HA含量的优劣。3.1 实验材料3.1.1 主要仪器SZ-3型自动三重纯水蒸馏器 沪西分析仪器厂KT-FDL-1封闭式可调电炉贺德实验设备FA1104电子分析天平精密科学仪器G53紫外可见分光光度计 棱光技术DHG-9104A电热恒温鼓风干燥箱 精宏实验设备HZQ-C型空气浴振荡器 市东明医疗器械厂TGL-16B高速台式离心机安亭科学仪器厂3.1.2 主要试剂（1）透明质酸标准品（医用级）；（2）发酵液：12.5g/L蛋白胨，12.5g/L酵母粉，12.5g/L葡萄糖，2g/L NaCl，0.4g/L Na2HPO4；（3）CTAB溶液：2.5g或0.5gCTAB溶于100mL2%NaOH溶液中，2.5 g CTAB溶于100 mL 2%NaCl溶液中；（4）咔唑试液：25mg咔唑溶于20mL无水乙醇中；（5）乙酸缓冲溶液：0.2mol/L CH3COONa，0.15mol/L NaCl，用乙酸调pH至6.0；（6）磷酸缓冲溶液：87.7 mL 的0.2mol/LNaH2PO，12.3 mL的0.2mol/LNa2HPO4；（7）Tris-HCl缓冲液：50mL 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与29.2 mL 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100mL。3.2 实验方法3.2.1透明质酸的初步纯化将发酵液与0.1%（w/v）十二烷基磺酸钠（SDS）等体积混合，室温温浴10min以释放细胞外壁附着的HA。经4500r/min离心10min，去除菌体，取上清液，加入2.5倍体积无水乙醇，在4静置1h，12000r/min离心取沉淀，加入与发酵液等体积的去离子水溶解56，取1mL进行HA测定。3.2.2 CTAB比浊法适量浓度的透明质酸溶液与乙酸缓冲液混合，终体积为1 mL，室温加入2 mL一定浓度的CTAB溶液均匀混合，反应一定时间后在特定波长下测定混合液的浊度A。根据A与HA浓度之间的线性关系，绘制标准曲线。3.2.3改良Bitter-Muir法3 mL浓硫酸置于试管中，1 mL样液或HA标准液小心置于浓硫酸上层，开始轻轻振摇，然后剧烈振摇，并使之在冰浴中不断冷却，将试管在沸腾的去离子水中加热一定时间，冷却至室温加入0.2 mL咔唑试液，再次摇匀，在沸水浴中加热一定时间，冷却至室温，在特定波长下测定吸光度A。3.3 结果与讨论3.3.1 CTAB比浊法3.3.1.1 缓冲溶液对反应体系的影响为考察不同缓冲溶液对HA-CTAB反应体系吸光度的影响，本实验分别称取9 mg HA标准品溶解于100 mL乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液和去离子水中，配制成浓度均为90 g/mL的HA标准液。并分别与25 g/L的CTAB溶液反应10 min，在200-800nm波长围进行扫描。实时谱图显示不同缓冲溶液对HA-CTAB反应体系的吸光度值基本无影响。因此，为了节约试剂，简化实验步骤，后续实验采用去离子水配制HA标准液。3.3.1.2CTAB溶液配制对反应体系的影响本实验考察了CTAB溶液的配制对HA-CTAB反应体系吸光度的影响。浓度为90 g/mL的HA标准溶液分别与25 g/L CTAB(NaCl)溶液和25 g/L CTAB(NaOH)溶液反应10 min，在200-800 nm波长围进行扫描。由图3-1可知，HA-CTAB(NaCl)反应体系的吸光度非常小，接近于CTAB溶液的吸光值，基本观察不到混浊现象；而HA-CTAB(NaOH)反应体系的吸光度较大，混浊现象明显。说明在碱性条件下，HA与CTAB的络合反应较充分。另外，吸光度太小，实验误差对测量结果的影响较大。因此，后续实验采用将CTAB溶于NaOH溶液。图3-1 不同CTAB溶液与HA反应体系的扫描光谱Fig 3-1 The cure of spectrum of the HA-CTAB complex under different CTAB concentrations3.3.1.3 不同浓度反应体系的全波长扫描图谱为选择合适的检测波长围，将浓度分别为30、60、90、120和150g/mL的HA标准液与25 g/L CTAB溶液反应10 min后，在200-800 nm波长围进行扫描，结果如图3-2。图3-2不同浓度的HA标准液与CTAB反应体系的扫描光谱Fig 3-2 The cure of spectrum of the HA-CTAB complex under different HA concentrations透明质酸是一种酸性粘多糖，没有紫外吸收，但在250nm附近出现吸收峰，这是反应体系中过量的CTAB的特征吸收峰。在一个较宽的波长围（350 nm-800 nm），各种浓度HA标准液的反应液光谱曲线分布都较均匀。3.3.1.4 最佳波长的确定为确定最佳检测波长，分别在400 nm、500 nm、600 nm、700 nm处测定浓度为30-150g/mL标准液反应体系的吸光度，并回归方程。由表3-1可知，在上述波长处，吸光度与HA标准液浓度均有较好的线性相关性，但400 nm处R值（0.9998）最高。因此本实验选择400 nm为最佳检测波长。表3-1 基于不同波长的回归方程Table 3-1 the regression equation based on different wavelengths波长/nm回归方程相关系数R400nmy=0.0074x-0.0342R=0.9998500nmy=0.0051x-0.0334R=0.9987600nmy=0.0045x-0.0657R=0.9912700nmy=0.0035x-0.0500R=0.9