中度嗜盐菌Vibrio sp.K1L一种噬菌体的分离、鉴定毕业论文

存档日期： 2011年06月 存档编号： 本科生毕业论文（设计）论 文 题 目：中度嗜盐菌Vibrio sp.K1-L一种噬菌体的分离、鉴定姓 名： 院 系： 生命科学学院 专 业： 生物技术 年 级、班 组： 指 导 教 师： 徐州师范大学生命科学学院印制中度嗜盐菌Vibrio sp.K1-L一种噬菌体的分离、鉴定 摘要：用从山西运城盐湖水样中分离到的一株中度嗜盐菌Vibrio sp.K1-L做为指示菌筛选从同处水样中的噬菌体，将获得的其中一种命名为AD的噬菌体。我们从生理和生化角度对其做了研究；对噬菌体基因组以及结构蛋白做了研究；用扫描电镜观察到了噬菌体结合到指示菌表面的现象。关键词：噬菌体；盐湖；中度嗜盐菌Isolation and Characteraztion of a Phage infecting moderately halophilic Vibrio sp.K1-LYoukeji Supervisor:Wang Ziyuan(School of Life Sciences, Xuzhou Normal University, Xuzhou,Jiangsu,221116,China)Abstract: A moderately halophilic bacterial strain Vibrio sp.K1-L，isolated from Yuncheng Saline was used as indicator to scan the water sample from the same location for phage detection. One phage, designated as was isolated. Physiological and biochemical characterization of this phage were conducted. The Investigation of phage genome and structure proteins were performed. This phage is capable of binding on the surface of indicator cells of Vibrio sp.K1-L and was clearly demonstrated by scan electron microcopy. Key words : Phages；Saline；moderate halophiles.目 录引言31 材料与方法3 1.1 供试材料 3 1.2配置培养基材料 4 1.3实验器材 4 1.4嗜盐菌噬菌体的获得 5 1.5噬菌体的验证 5 1.6噬菌体的删选及纯化 6 1.7氯仿耐受性试验 6 1.8噬菌体的大量培养 7 1.9噬菌体的过滤及浓缩 7 1.10对噬菌体浓缩液进行SelfinoseTM 4B琼脂糖凝胶过滤层析 7 1.11噬菌体DNA的电泳 71.12噬菌体蛋白质SDSPAGE凝胶电泳 81.13噬菌体电镜观察 82 结果与分析92.1噬菌体的确认 9 2.2噬菌体DNA电泳 10 2.3噬菌体蛋白质SDSPAGE凝胶电泳 12 2.4噬菌体的电镜观察 12 3 讨论134结果 13致谢14参考文献14引言噬菌体（bacteriophage,phage）是寄生于细菌、放线菌、真菌等微生物的病毒,体积微小,结构简单,广泛分布于自然界中，凡是有细菌的场所，都可能有相应的噬菌体存在。根据噬菌体与宿主菌的关系，可分为裂解性噬菌体和溶原性噬菌体。前者可在敏感宿主菌内增殖,并使之裂解；后者基因组整合于宿主菌基因组中,成为细菌DNA 的一部分,不单独复制。 鉴于噬菌体有溶菌作用和严格的宿主特异性,可利用噬菌体作细菌的鉴定和分型,亦可用于检测标本中的未知细菌和防治某些传染病1 2。由于噬菌体结构简单、基因数少，是分子生物学和基因工程的良好实验系统。噬菌体自被发现以来,就被作为基因复制及表达调控研究的模型。直到上世纪末，抗生素的滥用而产生耐药菌株和畜禽产品药物残留等问题的日益严重，大量耐药菌株的出现使得抗生素在细菌疾病的治疗上不再那么有效，噬菌体作为抗菌治疗生物制剂的研究才又重新受到人们的关注。目前噬菌体制剂已受到许多国外生物技术公司的重视,噬菌体研究又成为国外科研机构的研究热点之一。噬菌体是在自然界的数量庞大。噬菌体基因本身就是十分重要的生物自然。 因此分离筛选研究新的噬菌体是一现十分重要的工作3。本实验以山西运城的一株中度嗜盐菌为宿主菌，分离筛选选出特定的噬菌体，为后续研究作准备。1 材料与方法1.1供试材料（1）菌种：从盐湖水中分离出的Vibrio sp.K1-L嗜盐菌（2）实验用具：玻璃平板，试管，试管架，玻璃烧杯，塑料烧杯，移液管，酒精灯，超净工作台，60恒温水浴锅，180 恒温烘箱，37恒温培养箱，液体摇床培养箱，高压灭菌锅等实验器材1.2 配置培养基材料（1）配置30%的Salt Water4表1 30%海水配方Table1 30% Seawater Recipe 药品用量NaCl240gMgCl.6H2O30gMgSO4.7H2O35gKCl7gCaCl2 (1ml/L)5ml/L 用1M NaOH 调至pH7.5， 用量约为 2ml /L。 加纯水定容至1L （2）配制15%的MGM（液 400 ml） 表2 15%的MGM配方 Table1 15% MGM Recipe药品用量Salt Water200 mlPuer Water187 mlPeptone2 gYesat0.4 g 配置25%的MGM（液 500 ml）表3 25%的MGM配方Table1 25% MGM Recipe药品用量Salt Water417 mlPuer Water67 mlPeptone2.5 gYesat0.5 g 用1M NaoH调PH至7.5 , 约2000uL（3）配置病毒稀释液VDS （Dilute Solution of Virus） VDS = 30%SW + 无菌水 例：6mL 20%VDS = 4mL 30%SW + 2mL无菌水 1.3实验器材VS-840-1超净工作台 上海博讯实业有限公司医疗设备厂MLS-3020高压灭菌锅 SANYO Electric Co.,LtdDNP-9052型电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司Galanz WD700型微波炉 佛山市顺德区格兰仕电器有限公司DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司MDF-382E超低温保存箱 SANYO Electric Co.,LtdTHZ-C恒温振荡器 江苏太仓市实验设备厂摇床培养箱ATL-031 Shanghai Chemstar Instraments co.LtdLHS-100CL型恒温恒湿培养箱 上海绿宇精密仪器制造有限公司生产LRH-250-GS型人工气候箱 广东医疗器械厂生产H1650-W型高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司生产TC-25/H型基因扩增仪 杭州博日科技有限公司生产LG2000型凝胶成像仪 杭州市朗基科学仪器有限公司生产HZ-2011-KA型震荡培养箱 太仓市科教器材厂生产DYY-6C型电泳仪 北京六一六亿仪器厂生产1.4 嗜盐菌噬菌体的获得 采用直接倒平板法分离嗜盐菌噬菌体5 6 采集水样。 将细菌和其它固体颗粒离心5000r/min，10 min沉降。上清液备用。 将100uL盐湖水样上清液和150uL(处于对数生长早期的受体菌k1培养液加入到已融化且保持在50的0.5%琼脂中，混匀。 倒入已准备好的培养皿中(30mL MGM 10%SW 1.5%琼脂 若事先置冰箱中先取出预热至室温），快速左右晃动，使上层琼脂覆盖全培养皿。 将培养皿过夜倒置培养(37），于第二天观察有无噬菌斑的出现。1.5 噬菌体的验证 在观察到噬菌斑的培养皿中，用移液器吸取形态典型，和其他噬菌斑有较大空间的噬菌斑上层培养基，在一预先存入200uL VDS(噬菌斑稀释缓冲液）新的1.5mL反应管中反复上下吹打，然后漩涡振荡1min。此为噬菌体保存液。 将50mL纯细菌和3mL 0.5%的琼脂混匀，均匀分布在底层培养基上，然后取2uL噬菌体保存液，滴在预先标记的部位，过夜培养，于第二天观察。若观察到所标记的部位出现溶菌现象，则证明该噬菌体能够感染所用菌株。可以进行下一步纯化。1.6 噬菌体的筛选及纯化7 8准备：由于噬菌体的数量庞大，在实验前我们必须对其液体进行稀释方法：取上一步获得的噬菌体保存液2uL，加入到198uLVDS即总稀释100倍，然后再从上面的200uL液体中取10uL，加入到90uLVDS中即总稀释10倍，接着以10倍的差距继续稀释，以达到所需稀释倍数。 前一天在液体培养的试管中加入新鲜培养液，以便菌种正好生长至对数期，以利于第二天的接种。对2.5%MGM 1.5%Agard的固体培养基(底层培养基）和2.5%MGM0.7%Agar(上层培养基）进行灭菌，然后底层培养基倒平板并写上相应的时间，将平板放在超净工作台上至冷凝后待用，同时对k1菌进行液体培养。 第二天，在超净工作台中操作，将昨天准备好的平板先放置在37恒温箱中保温并开启水浴锅定温度到50，将数支灭菌试管插在试管架上放入水浴锅保温，然后按照稀释方法对噬菌体保存液进行稀释，取EP管分别与稀释度相对应，点燃酒精灯，在EP管中先加50uL k1细菌液，然后取一定10微升的噬菌体稀释液到EP管中，Vortex,然后放置30min，使噬菌体有充分时间感染细菌。等时间差不多的时候在微波炉中加热上层培养基，用移液管吸取3mL到水浴锅中的试管里，接着再加5060uLVDS至EP管中(方便吸取EP管中的液体)，将EP管所有液体转移到试管中，快速Vortex混匀，避免产生气泡。取出平板，标上日期，写明相应稀释度，快速将相对应的试管里的液体倒入平板上，左右晃动使之覆盖平板，待干后置于37的温箱中倒置过夜培养。顶层agar（0.5%）底层agar（2.5%） 次日，观察平板上的噬菌斑，挑取形态典型，和其他噬菌斑间隔大的噬菌体重复上述步骤。经过多次重复删选，直到获得现状一致的噬菌斑，可以认为噬菌斑得到了纯化。1.7 氯仿耐受性试验 噬菌体悬液加三分之一体积的氯仿，剧烈震荡1min，然后静置1h，将样品离心与氯仿分离，上清液中存活的噬菌体用来检测活性。1.8 噬菌体的大量培养 本实验采用平板法：取50uL细菌培养液加入300010000pfu的噬菌体，混合，室温孵育10min，倾倒至3mL TopAgar中，快速漩涡振荡后倒入已准备好的培养皿中，第二天，取5mL噬菌体稀释液加入到过夜培养至conflunt的培养皿中，将TopAgar刮至一边，用移液器移至离心管中，在6000rpm 4条件下离心20min，上清夜中含有大量噬菌体可用于进一步研究。1.9 噬菌体的过滤及浓缩 上一步离心好的上清液经0.22um滤膜过滤，除去剩余的细菌。 取0.5mL保存，剩下的噬菌体液加RNA酶和DNA酶(RNA酶的原浓度为10mg/mL,DNA酶原浓度为250mg/mL，体积都为噬菌体液的十分之一，两者共同作用除去噬菌体扩增液中细菌裂解后释放的染色体DNA和RNA），然后在37条件下消化1h。 接着向噬菌体扩增液中家NaCl至1M，加PEG6000固体，终浓度为10%(w/v），混匀溶解后4过夜，PEG6000沉淀噬菌体，获得噬菌体浓缩液。1.10 对噬菌体浓缩液进行SelfinoseTM 4B琼脂糖凝胶过滤层析 经PEG沉降的噬菌体溶液以6000rpm离心30min，弃上清液，沉淀用2mLSW溶解。 用相应缓冲液(5%SW）充分平衡后，取1mL样品上样，以1mL/min流速洗脱，1mL/管收集过柱后溶液，共各25 EP管，记录所测峰值。 样品收集完后，用23倍与柱体积的2.5%SW清洗凝胶柱，然后将凝胶柱在4条件下保存待用。注：本次实验所浓缩得到的噬菌体为k1菌的某一种噬菌体，其噬菌斑比较大，故而称其为KD，以下文章涉及KD都是此种噬菌体。1.11噬菌体DNA的电泳 取层析后KD峰值管，取出400uL于新的EP管中，分别加 表4 电泳样品配方 Table4 Electrophoresis sample recipe药品用量终浓度无菌水800uLSDS （10%）48ULEDTA（500mM/L）12uL蛋白酶K （20mg/mL） 3uLTris-HCl，pH7.5， 1M 12uL 反应条件：56，1h（2） KD按0.7倍体积加入异丙醇(有絮状沉淀），室温保存3h。（3） 离心，吸取掉EP管中的异丙醇，加入100uL70%乙醇，离心13000rpm， 2min 倒去上清液，加入50uL无菌水，混匀，然后吸取4uL点样至电泳槽(加1uL加样缓冲液），用1%琼脂糖凝胶电泳，55min，75V。剩余样品-20保存。 泳结束后，胶放入EB中，染色15min。拍照1.12 噬菌体蛋白质SDSPAGE凝胶电泳按以下比例制备电泳用凝胶：12%分离胶 5%浓缩胶dd H2o： 3.45mL 1.425mLAcrBis: 4.00mL 425uLBuffer： 2.5mL 0.625mL10%SDS: 0.1mL 25uL10%APS: 50uL 12.5uLTWMED: 适量（30uL） 15uL 先配好分离胶，将电泳槽组装好，先将配好的分离胶装入电泳槽，快到接近顶的时候加入水，等待分离胶凝固（剩余分离胶可作为分离胶凝固的标准），配好浓缩胶，将电泳槽中的水倒掉，加入浓缩胶，插入梳子，等待浓缩胶凝固。注：胶中不能留有气泡，以免影响电泳。 配50uL样品 5待电泳样：2加样缓冲液，然后煮沸5min，取30uL样品待胶凝固后加样。 连接设备电泳，首先85V 跑2h，然后取下胶，在固定液中固定30min，接着将胶放入染色液中染色40min，完后将胶加入脱色液中进行脱色，一般以三遍为准，最后当放入水中让其自然褪色。（在固定和脱色之前，都要将固定液和脱色液在60水浴下预热）对胶进行拍照。1.13 噬菌体电镜观察试剂准备：4%戊二醛：吸取25%戊二醛1份，无菌水5份，混匀共3ml2%戊二醛：吸取4%戊二醛1份，无菌水1份，混匀共2ml 5%Salt Water 配制梯度乙醇：20%、50%、80%、无水乙醇 100%叔丁醇（1）实验前一夜制备细菌悬液（2）将所需试剂放在4预冷30min（除叔丁醇，其结晶点为23.5）（3）吸取500l菌液于1.5ml离心管中，6000rpm离心10min，吸去上清液，加入噬菌体5l，室温放置10min（4）加100l5%Salt Water，移液器吹匀，4000rpm离心5min，吸去上清。（5）加400l4%戊二醛，移液器吹匀，0冰箱固定60min（6）4000rpm离心5min，弃上清，加400l5%Salt Water，移液器吹匀。4000rpm离心5min，吸去上清。（7）加400l2%戊二醛，移液器吹匀，0冰箱30min（8）4000rpm离心5min，弃上清，加400l5%Salt Water，移液器吹匀。4000rpm离心5min，吸去上清。（9）梯度乙醇20%、50%、80%、无水乙醇脱水。依次各梯度乙醇400l和菌体混匀后，0静置10min，4000rpm离心5min，吸去上清。（10）加100%叔丁醇400l置换100%乙醇，混匀后放置十几分钟。（11）将准备好的纯化的高滴度噬菌体溶液滴至300目的聚醋酸甲基乙烯脂和碳包被的铜网，干燥15min至多余水分完全消失。接着用2%磷钨酸负染色。用zeiss EM10透射电镜在不同放大倍数下观察。拍照分析。2结果与分析2.1 噬菌体的确认图 1 K1菌的噬菌斑Firure 1 K1 plaque bacteria结果：我们首先用双层平板法检测所采盐湖水样是否有可以感染Vibrio sp.K1-L的噬菌体。所得结果如图一，显示有典型的噬菌斑存在。证明该菌有多种噬菌体可以侵染。 图 2 K大噬菌体造成的噬菌斑 Figure2 K caused a large phage plaques结果：经过对Vibrio sp.K1-L噬菌体的删选，删选出造成噬菌斑较大，边缘较整齐的噬菌体，再经过多次的纯化后，所得结果如图2，图中所示噬菌斑大小不一致，但大致形态相似，我们认为该噬菌体造成的噬菌斑就是该形态。 2.2 噬菌体DNA电泳 图3 噬菌体核酸提取物 Figure3 Phage nucleic acid extract结果：通过对噬菌体的核酸物质提取后，跑电泳，所得结果如图3所示，从左起第一条带为标准样品，第三个条带为噬菌体核酸物质，从图可知该噬菌体的有大量的核酸物质且大小在23000以上。 图4 加入RNA酶处理后 Figure4 RNA added after enzyme treatment图5 加入DNA酶处理后Figure5 After adding DNA enzyme treatment结果：为确认噬菌体核算物质是DNA还是RNA，将其分别用DNA酶和RNA酶处理后跑电泳,所得结果如图4和图5所示，从左起开始的第一条带为标准样品， 图4经RNA酶处理后电泳后无条带，图5经DNA酶处理后电泳后有条带，对比得出该噬菌体以DNA为遗传物质。2.3噬菌体蛋白质SDSPAGE凝胶电泳 图6 蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳 Figure6 SDS - PAGE gel electrophoresis of protein图7 噬菌体浓缩后浓度的测定（以吸光度为标准）Figure7 After the determination of the concentration of phage concentration (in absorbance as the standard)结果：选取适当量的噬菌体进行蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳，所得结果如图6所示，从右起第一条带为标准样品，经过两次相同的电泳对比，可以得出该噬菌体外壳有多种蛋白质组成且大小有层次分布，之后噬菌体经过过柱浓缩后以吸光度为标准测定其最大浓度，如图7所示，最大峰值近0.45。2.4 噬菌体的电镜观察结果：将Vibrio sp.K1-L进行噬菌体的侵染实验，然后在扫描电镜下观察，如图8所示，下图为光细菌的形态，上图为经过侵染后细菌的形态，细菌表面有颗粒状物质，电镜放大倍数比较大，基本可以排除盐颗粒的可能，所以可以确定其为该细菌的噬菌体。图8 K大噬菌体的电镜图 Figure8 K large electron micrographs of phage 3 讨论在实验过程中，我们翻阅了许多文献，也进行可很多的尝试，比如在开始阶段，对于噬菌体的大量培养，我们尝试过不同的盐浓度9，试用过液体培养法，最后确定了用双层培养法培养噬菌体10，再通过分离获得高浓度的噬菌体，但这种方法比较繁琐，随机性比较大，容易产生误差，比如所测噬菌体的量变化比较大，对此，噬菌体的保存，培养基的营养成分，宿主菌的新鲜程度有很大影响，后续实验培养噬菌体应注意这些方面。初步分离得到的噬菌斑形态来看，大小不一致。边缘有些整齐，有些毛糙。我们选择了噬菌斑大，边缘整齐的噬菌斑进一步纯化分离。 但是经过多次纯化步骤，仍然会出现大小不均匀，两种边缘都出现的噬菌斑。因此我们确定该噬菌体是单一纯化的噬菌体。出现噬菌斑不一致的情况可能和寄主菌能够群游有关。 再者，在做蛋白质凝胶的时候，从培养基上所刮下来的物品中，细菌的浓度大，过滤噬菌体后，容易堵塞过滤柱，对于过滤柱的保养要做到位，以免下次实验出现错误。4结果本实验得出以下结果：首先，我们从运城盐湖水样中经分离得到了一株能够感染K1菌的烈性噬菌体。 接着，我们对该种噬菌体进行了纯化和鉴定，证明该噬菌体遗传物质是双链DNA。电镜观察表明，噬菌体通过附着到细菌细胞表面受体感染细菌。由于宿主菌是范家同学长获得的新型菌种，而且对运城盐湖至今没有有关噬菌体研究的报道，因此可基本确定该种噬菌体为新型噬菌体。致谢通过本次毕业设计，我感受颇多。从查找收集资料到设计方案的确立，一直到最后的设计完成，其间的每一步骤都十分重要必不可少的，极大地增进了自己对所学知识的理解和对新知识的学习，培养了严谨的工作作风和态度。同时也进一步认识到：做任何事都是一个不断完善改进的过程，一定要踏实严谨，又要敢于不断创新。本课程设计是在王子元教授的悉心指导下得以完成的。在毕业实验期间王子元教授不仅从实验方向、实验思路中给我认真的指导，而且对具体的实验过程提供有益的指导和帮助。他工作认真负责、为人师表，这些优点都是我将在今后的工作和学习生活中要不断学习的。谨在此向他表示最诚挚的感谢！另外在此还应特别感谢我的同学陈妮娜、研究生范家同、成守亮、马英、耿苗、刘抗，实验员老师及所有教过我、给我指导过的老师，祝工作顺利，万事如意！参考文献 1 陈晓春,王继文,曹永长,毕英佐,马静云. 噬菌体在疾病治疗方面的应用及研究J. 动物医学进展, 2005,(012 王盛,童贻刚. 噬菌体治疗研究进展J. 微生物学通报, 2009,(07) .3 孙荣华,李菁华等. 大肠埃希菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性研究J.中国病原生物学杂志, 2009, 4(2)：88-104.4Dr.Mike.Dyall-smith.Protocols for haloarcheal genetics. .Version 7,March2008.12 5 Rupniak HT. Hill BT,Studies with a clonogenic assay for tumor cells from human biopsy material and its comparison with other survival assay .Br J Cancer, 1980, 41(4) suppl :255 . 6 巢卫, 彭祥鄂, 叶雨文. 体外双层琼脂培养法检测抗癌药对人癌干细胞集落形成的能力J. 中南大学学报(医学版), 1986,(03)7 侯宁, 刘春光, 吴郁文, 张翠兰, 张炎. 双层培养基中小麦赤霉病抗性表现J. 植物病理学报, 2003,(01)8 吴中心, 姚根怀, 张同庆, 李扬立, 刘凤兰, 王素芹, 宋会远. 利用双层培养基筛选烟草抗赤星病突变体J. 华北农学报, 1993,(S1)9白雪冬; 吴敏; 李遂焰. 一株嗜盐菌新种的分离与鉴定J. 生物技术，2001,(01)10Chawla HS et al. In vitro selection of barley and wheat for resistance against Helminthosporium sativum .Theor Appl Genet, 1987, 74 :841 .徐州师范大学毕业论文 (设计)评阅人意见表姓 名院系生命科学学院学号专业题目评阅人姓名职称研究方向评 价 项 目ABCD选题质量01选题符合专业培养目标，体现综合训练基本要求02题目难易度03题目工作量04理论意义或实际价值能力水平05查阅文献资料能力06综合运用知识能力07研究方案的设计能力08研究方法和手段的应用能力09外文应用能力成果质量10对实验结果的分析能力（或综合分析能力）11图表的质量或插图（或图纸）质量12论文（或设计说明书）写作水平与写作规范13篇幅（正文部分不少于4000字）14成果的理论或实际价值评阅人评定成绩评 阅 人 评 语（如不够填写，可另附纸）评阅人（签名）： 年 月 日本科毕业论文（设计）答辩记录表学院：生命科学学院 系别： 专业：_ 姓 名学 号答辩时间毕业论文（设计）题目：评价内容具 体 要 求评 分ABCD报告内容思路清晰；语言表达准确，概念清楚，论点正确；实验方法科学，分析归纳合理；结论严谨；论文结果有应用价值。创 新对前人工作有改进或突破，或有独特见解。答 辩回答问题有理论根据，基本概念清楚。主要问题回答准确、有深度。答 辩 记 录答辩成绩评 分 人姓 名职 称徐州师范大学本科生毕业论文（设计）成绩评定表姓 名院 系专 业年 级学 号论 文 题 目论 文 内 容 提 要指 导 教 师 意 见 评定成绩： 指导教师 （签名） 年 月 日答 辩 小 组 意 见论文答辩成绩： 答辩组长： （签名） 年 月 日院系意见 综合评定成绩： （签名） 年 月 日注：答辩小组意见包括答辩中主要问题及回答的简要情况、投票结果、论文评语、论文成绩。 21