质粒构建中DNA片段与载体连接的经验

在排除了其他问题后，我做了摩尔比的调整，需要做OD260的测量。不要怕浪费回收的载体和片段因为实际用量非常少，看了下面我们的实验实例就知道了。摩尔比是指载体和插入片段，在连接时的摩尔比。1 比例应该在1:2-6之间（载体：片段；片段要多）。2 连接体系如果是20微升，载体和片段的总质量（微克）要在0.02微克0.2微克之间。如果是10微升，则在0.010.1微克之间。我一般都用到接近上限。3 EDTA不能太多。否则可能影响连接酶。附加：如何计算摩尔数和微克数（用20微升的链接体系，NEB的T4 DNA ligase）公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数实例：片段大小=555bp=0.555kb，浓度=0.19微克/微升载体大小=4.969kb，浓度=0.115微克/微升选取：载体0.04pmol ;片段0.12pmol （载体：片段=1:3）代入公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数；载体用0.129微克（1.12微升）；片段用0.043微克（0.23微升）:注意20微升体系 得出：载体和片段的总质量 =0.043+0.129=0.172微克（在20微升体系所要求的 0.020.2微 克之间）连接体系：体积按需调整，20ul体系：我们喜欢用20ul的体系。你如果要用10ul的，把上述用量减半。3d水片段载体将上面二个液体混匀，15.65 ul,0.23 ul,1.12 ul,45摄氏度水浴5min，迅速插入冰中，2min保持在冰浴中，加入10X buffer2 ulT4 DNA ligase 1 ul混匀，4C连接过夜另外一种推算结果设x1为DNA片段pmol数，x2为其ug数；设y1为载体pmol数，y2为载体ug数，a为DNA片段的kb数，b为载体的kb数，并且假定摩尔比为 DNA片段：载体=3:1，则有y2=0.2/(3a/b+1)X2=0.2-y2X1 a 0.65=x2y1 b 0.65=y2X1: y1=3X2+y2=0.2 （总质量）最后提示：不要怕测 OD260 浪费了回收的载体和片段，因为实际上用的很少（见上述） 。不要嫌测 OD 值麻烦，因为非常必要，尤其是连接效率不高的质粒和片段。根据酶切电泳条带估计用量通常都不能得到最大的连接效率， 对初学者来说， 估计通常不准。 我有一次，按照估计的，两个板子才有一个克隆；按照摩尔比 1:3 连接得到了大约 150 个克 隆；按照摩尔比 1:10 只得到了平均 15 个克隆 /板。这说明：片段过多，过犹不及。