2017年主管检验技师考试临床免疫学和免疫检验讲义第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备

第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的原理是利用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测、筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。杂交瘤技术是一项周期长和高度连续性的实验技术，涉及大量的细胞培养、免疫化学等方法。具体包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选与克隆化等。一、杂交瘤技术（一）小鼠骨髓瘤细胞 1.细胞株稳定，易于传代培养。2.细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。3.该细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷株。4.目前最常用的骨髓瘤细胞是NS-1和SP2/O细胞株。（二）免疫脾细胞免疫时选用与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠，鼠龄812周，体重约20g，雌雄均可，但必须分笼。免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法。如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫。（三）细胞融合细胞融合是产生杂交瘤细胞的中心环节。PEG（聚乙二醇）有助于细胞融合。常用PEG分子量1000D、1500D或4000D。（四）杂交瘤细胞的选择性培养将经过融合的细胞置于含有次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷的HAT培养基中。1.脾细胞：在一般培养基中不能生长繁殖。2.骨髓瘤细胞：采用的小鼠骨髓瘤细胞都是HGPRT或TK代谢缺陷型细胞，在HAT培养基中，不仅合成DNA的主要途径被氨基蝶呤阻断，又因缺乏HGPRT或TK而不能利用次黄嘌呤，虽有TK可利用胸腺嘧啶核苷，但终因缺乏嘌呤不能完整合成DNA，而使骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡。3.杂交瘤细胞：骨髓瘤细胞与脾细胞融合，获得HGPRT，可以利用次黄嘌呤合成DNA，故可以存活。二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存单个细胞培养又称克隆化。细胞克隆化一般至少进行35次。克隆化有以下几种方法：（一）有限稀释法 操作简单，出现率高，为实验室最常用的方法。（二）显微操作法 直观可靠，但操作时间过长，容易增加污染机会。（三）荧光激活细胞分选仪 先进、高效、高纯度、昂贵。（四）软琼脂平板法 本法缺点是琼脂融化温度较难掌握，过高会导致细胞死亡，过低使细胞分布不均匀，操作较复杂，克隆出现率不稳定。杂交瘤细胞应及时冻存，以保证细胞不会因污染或过多传代变异丢失染色体而丧失功能。目前均采用液氮保存细胞。细胞放入液氮前，需要逐步降温。可将冻存管放置于-80深低温冰箱过夜后再放入液氮中，即可以长期保存。特别注意应及时补充液氮以保证液氮量不低于总容量的1/3，以防止前功尽弃。复苏细胞时，从液氮罐内取出冻存管，立即浸入37水浴，轻轻摇动，使之迅速融化，随即轻轻将细胞移入10ml培养液，使二甲亚砜稀释，低速离心10分钟，弃去上清液，加人RPMI1640培养液悬浮细胞。第二节单克隆抗体的制备经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。一、单克隆抗体的产生（一）动物体内诱生法 目前McAb治疗用或体外诊断用的多数尚采用这一方法制备。小鼠腹腔接种杂交瘤细胞悬液1014天，无菌抽取腹水，离心取上清液即可。（二）体外培养法 这是实验室制备的方法。将杂交瘤细胞置培养瓶中培养，收集上清液，离心去掉碎片及细胞即可。二、单克隆抗体的纯化从培养液或腹腔积液获得的单克隆抗体，不需要纯化即可应用于日常诊断或定性研究。如果用于免疫标记测定，如放射性核素、酶、荧光素或生物素标记等，必须进一步分离和纯化。可用半饱和、饱和硫酸铵进行沉淀，达到初步浓缩和纯化的目的。经过适当溶解和充分稀释后，可用亲和层析法进一步纯化。三、单克隆化抗体的性质鉴定（一）Ig类型测定（二）特异性测定（三）抗体效价测定：效价以腹腔积液或培养液的稀释度表示，稀释度越高，则抗体效价也越高。（四）表位测定（五）亲和力测定：只有当抗原与抗体结合部位结构完全吻合时，抗体的亲和力最大。这种结合力以抗原抗体反应平衡时，抗原与抗体浓度的乘积与抗原抗体复合物浓度之比表示。如亲和力太低，会严重影响测定的敏感性。（六）染色体分析四、单克隆化抗体的特性（一）单克隆抗体的特性1.高度特异性2.高度的均一性和可重复性3.弱凝集反应和不呈现沉淀反应4.对环境敏感性单克隆抗体易受环境的pH、温度和盐类浓度的影响，使其活性降低，甚至丧失。总之，单克隆抗体越纯，对温度越敏感，而杂蛋白及其他抗体分子可使单克隆抗体的耐热性增强。单克隆抗体受pH的影响较多克隆抗体明显，而且抗体越纯，对pH越敏感。低浓度的NaCl对单克隆抗体可能有一定的保护作用。（二）单克隆抗体的优点1.杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。2.可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。3.由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。4.由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。（三）单克隆抗体的局限性1.单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。2.单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。3.制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也昂贵。第三节基因工程抗体的制备原本的抗体多来自于异种动物，具有较强的抗原性，不能应用于人体，故利用基因重组和蛋白工程技术将其进行改型，称为基因工程抗体。其优点包括：通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；根据治疗的需要，制备新型抗体；生产成本低。一、人源化抗体主要目的是减少抗体的异源性，以利于临床应用。虽然嵌合抗体的免疫原性明显低于鼠McAb，但由于可变区仍保留鼠源性，为了进一步降低抗体的免疫原性，近年来在嵌合抗体的基础上构建了改形抗体。（一）嵌合抗体 从杂交瘤细胞中分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区的基因连接，构建鼠-人嵌合质粒载体，转染宿主细胞，表达鼠-人嵌合抗体。它的特点是大大减少鼠源性单克隆抗体的免疫原性，同时又保留了亲本抗体的特异性和亲合力。（二）改形抗体 将人抗体可变区中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲合力的人源化抗体。二、小分子抗体小分子抗体包括可变区（Fv）、单链可变区片段（ScFv）和单区抗体（SdAb）等。此种抗体分子量小，可在大肠杆菌等原核细胞表达，在人体内穿透力强，有利于疾病的治疗。三、抗体融合蛋白抗体融合蛋白是指利用基因工程技术将抗体片段与其他生物活性蛋白融合所得的产物。由于融合蛋白的不同，这种抗体融合蛋白具有多种生物学功能，并且表达的重组蛋白既不影响单链抗体的抗原结合能力，也不影响与之融合的蛋白质的生物学特性。四、双特异性抗体双特异性抗体（BsAb）又称双功能抗体（BFA），它的两个抗原结合位点具有不同的特异性，应用于结合两种不同的抗原分子，在生物医学中有着重要的意义。BsAb的种类有：1.化学交联BsAb：分别分离纯化两种不同的McAb，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法的缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。2.细胞工程BsAb3.基因工程BsAb：采用抗体分子片段，如Fab,Fv或ScFv，经基因操作修饰后，或体外组装为BsAb，或直接表达分泌型的BsAb。五、噬菌体抗体库技术将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性。1.基本原理和程序 噬菌体抗体库技术的原理，简言之就是用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面。构建噬菌体抗体库通常包括以下几个过程：从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并反转录为cDNA；应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段；构建噬菌体载体；表达载体转化细菌，构建全套抗体库。2.噬菌体抗体库技术的特点模拟天然全套抗体库避免使用人工免疫和杂交瘤技术可获得高亲合力的人源化抗体第四节单克隆抗体的应用一、检验医学诊断试剂单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。主要应用于病原微生物抗原、抗体的检测；肿瘤抗原的检测；免疫细胞及其亚群的检测；激素测定；细胞因子的测定。单克隆抗体对抗原的识别，与多克隆抗体有很大的不同。不同试剂盒因使用的单克隆抗体不同，识别抗原的位点不同，导致检测结果有一定差异。因此，标准化问题还需要进一步研究。二、蛋白质的提纯将单克隆抗体吸附在固相基质上，并制备成亲和层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。三、小分子抗体的应用1.肿瘤导向治疗2.放射免疫显像，协助肿瘤的诊断3.可在原核系统表达及易于基因工程操作四、抗体融合蛋白的应用1.肿瘤的体内显像诊断2.病毒的诊断和抗病毒感染3.血液疾病的诊断五、双特异性抗体的应用1.在体外免疫检测中的应用2.在体内肿瘤放射免疫显像诊断中的应用3.在体内免疫治疗中的应用六、抗体库技术的应用和前景1.在肿瘤体外诊断中的应用2.在肿瘤诊断中的应用3.在肿瘤治疗中的应用【习题】保留抗原抗体结合部位的最小功能片段是A.FabB.FvC.ScFv D.VHE.Fc正确答案B答案解析保留抗原抗体结合部位的最小功能片段是Fv。有关单克隆抗体的特点描述不正确的是A.理化性质高度均一B.特异性强C.纯度高D.亲和力强E.能无限增殖正确答案D答案解析单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。双特异性抗体的最主要特点是A.分子量大B.灵敏度高C.双特异性抗体的分子片段可在体外构建D.能同时结合两种抗原表位E.亲和力大正确答案D答案解析双特异性抗体的最主要特点是：能同时结合两种抗原表位。单链抗体属于A.人-鼠嵌合体B.小分子抗体C.抗体融合蛋白D.双特异性抗体E.二抗体正确答案B答案解析小分子抗体包括可变区（Fv）、单链可变区片段（ScFv）和单区抗体（SdAb）等。关于小分子抗体的描述错误的是A.不能通过胎盘B.易于穿透血管或组织C.采用干细胞技术D.属基因工程抗体E.不含Fc段正确答案C答案解析小分子抗体采用基因工程技术。关于单克隆抗体的应用，应除外A.肿瘤的诊断B.肿瘤的治疗C.血清补体活性测定D.激素水平测定E.细胞因子测定正确答案C答案解析关于单克隆抗体的应用，应除外：血清补体活性测定。