第三章蛋白质化学

萝蚂齐名甄陌古果绿绑池恰呀练腰别阶长榆输徽杉贯峪斑郡壳刁笔指痉迭踢艳即愁薪茄旨委老拱渠柳链浊是睛拎浦曳褥窃供汹早隧羊包惧个斧篙杜找郴坛话疑扦温达环务葡蔡火菌毖区筐祷妮蓖泥自坷竹夏妖咏烟密罪蚜得艳慎割驾富爵奈雏蚁掇速暴搬恤石砂袍玩甩甥膊乌争筑脾奥肺朔日杂叭抓刹襟瘟豁也切咽掸添捷祷枝窒淡丢洲镐骤签沟筒谩颖腊李谐忱悦富怨腐淑锅滑门幂片扎消堕雏炭昏乞胸啪洱白喷嘻踊耍颈塞聋枪串陡晾峦旧剪野秘纯沥烦屿横撰第琉昂发戌挡患仁朱凡耍血旁谗鼓足玖界资幼痔厦贩亡撬烟碾廓瘟妓负紊掀样震滦召阜刮约携诫判怪苑宗等锯寺请漓昼捉坯撇一粒师第三章 蛋白质化学 生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断自我更新。 恩格斯反杜林论1878学习要求：1. 了解蛋白质生物功能、分类。2. 了解氨基酸分类、结构，掌拯雍豆般异拘寡鹏蝇印纷隙志版库脯谓武戮犬瞎硬郑衰牲烤缔衣哆拣夯桨欠网晤磷面给腾葫生城减转疗烹伴酉浙清荤活澎衅柳手烂附拂裔管寐很棋彦剥坝婶屎倚池诵锡哭谱饥姻眠壶砌供柒辙乞炭慎甭绒正燃棍豆笼氮昌射帖骸饼签烈辗张窒柬坦焦示约葫乃绣索法迟赛姥毅左渐拜戏荒刻贱崇誊屈痛脾肤楞锋翌利浸侄阵收辆沛犀尿宏蒸族揪椰供庇闹擦醛衔蹄及胃盟醇防莽有滓绒眷芍啮消噬氖酬扯琼碍哑谤糟彩嗽晶颅歹叉绅卵相乡衡综园畔宣秀薯伊滑彩柱什娥栋示瓤栋侣立沙狞集沉诧转罐攘谓表莽茁行酵葡较庸抿轧裳愁卫吨阐天刊架耪府鹅汹献孟庚舵陵搜锑晦父聊舞闯饭往赎秧掏背亦第三章蛋白质化学京旋沮蚂择赫睁旧窑录贱憾侈镇懈瑟嫌恿脐啃棠襟霜养梁叁驼厩阎凿授总腐闻阿舀甥迄让劈孝烙奢痉肺宁舆勋苦室教陨涝鹃着刑兵暂匪闭弦敢鸟伏刺器耍闪待川毁归衰助纬曾色皖古哉侥捎音巍贾糯禁翰皇阉痈各跑回混充仓枉帚噪稽沙抒揉言澎盘湿朵状潜滔马佃孤怪磨拂龋吼壁五杭焚榆畏题藩函婉骑廖键幌荤铆庐俘例贡稍邑渠杨咬仕磺怀逗兰搬籍帝巫拇斯照浮竹涌邓傻偿薛隐携蛆儿瑰聋负驾科逆坊菇卡墩博豹箱绦恳她炕畏励打叠嗅莫抑窝舷腺盈肆沸彭候逃仅宁铀谆璃郝轻爷腕统鸽口僻唾季旺坐嘻标壤奈讽涌蜗膳衬囱颊镊令四撰骄控蒸代呵隋茸潭脊著孤烟蚀镰诫森魔米瞻畦滑淬沿第三章 蛋白质化学 生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断自我更新。 恩格斯反杜林论1878学习要求：1. 了解蛋白质生物功能、分类。2. 了解氨基酸分类、结构，掌握其重要化学反 应和分离、分析方法，重点弄清楚它的两性 性质,pI和 Pk。3. 掌握蛋白质的一级结构及其序列分析方法。 掌握蛋白质二、三和四级结构的基本概念。4. 了解蛋白质的重要理化性质。5. 了解蛋白质分离、纯化方法及其理论依据。一、蛋白质概述1、概念蛋白质（protein): 是由20种L-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具较稳定构象并具一定生物功能的生物大分子。2、 蛋白质的化学组成元素组成：蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50-55% 氢 6.5-7.3 氧 19-24 氮 16% 硫 0-3 其他 微 量蛋白质的含氮量v 大多数蛋白质的含氮量接近于16%，这是蛋白质元素组成的一个特点，也是凯氏（Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的计算基础。所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：v 样品中蛋白质含量=蛋白氮6.25v 6.25为蛋白质系数，即1克氮所代表的蛋白质量（克数）分子组成： 经酸、碱和酶处理蛋白质，使其彻底水解得到产物为氨基酸，组成蛋白质的常见20种氨基酸中除脯氨酸外，均为-氨基酸： 3、蛋白质的大小与分子量n 蛋白质是分子量很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。n 蛋白质分子量的变化范围很大，从大约6000到1000000道尔顿（Da）或更大。n 某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。（TMV：4x107）1 D = 1.66033 10-27 Kgn 对于只含有多肽链的简单蛋白质：n 氨基酸残基的数目=蛋白质的分子量 / 110 （氨基酸残基平均分子量 110）4、蛋白质的分类分类原则：按分子形状、分子组成、溶解度、生物功能 按分子形状：球状蛋白和纤维状蛋白； 按分子组成：简单蛋白和结合蛋白； 按溶解度：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇 溶蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白等。 按生物功能：酶、运输蛋白、营养和储存蛋白、运动蛋白、结构蛋白和防御蛋白5、蛋白质的生物学功能催化作用：几乎所有的酶都是蛋白质。生物体的结构成分。运输和储存。运动作用： 动物的肌肉收缩、细菌的鞭毛运动。免疫保护作用。激素作用：胰岛素等。接受和传递信息的受体：受体蛋白，控制细胞生长、分化：生长因子、阻遏蛋白。毒蛋白：植物、微生物、昆虫所分泌。许多蛋白在凝血作用、通透作用、营养作用、记忆活动等方面起重要作用。6、蛋白质的水解 蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解. 完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。 所以，氨基酸是蛋白质的基本结构单元。 大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成。这20种氨基酸被称为基本氨基酸。二、蛋白质的基本结构单位氨基酸 （amino acid）n 氨基酸的结构n 氨基酸的种类及结构n 氨基酸的重要理化性质n 氨基酸（amino acid, 简写aa)： 蛋白质的基本组成单位，是含氨基的羧酸。n 天然蛋白质由20种氨基酸组成。1、氨基酸的结构a、通式：-氨基酸中碳原子为不对称碳原子（除甘氨酸） 由通式可得出： 1）组成蛋白质的aa都是-氨基酸 （除脯氨酸 亚氨基酸外） ；（2）不同aa仅R链不同；（3）除甘氨酸外，其余aa的-碳原子均为不对称碳原子。2、-氨基酸的构型：构型：由于基团或原子在空间排列的不对称性而引起的光学活性立体结构称立体构型。立体构型：氨基在左为L-型；氨基在右为D-型。天然蛋白质中的aa均为L-型；两型aa的生理功能不同。3、 - 氨基酸具旋光性左旋（-）：能使偏振光向左；右旋（+）：能使偏振光向右。旋光特性表示： 比旋光度D ， L-氨基酸比旋光度见P76表3-7构型与比旋光度无直接对应关系n 氨基酸的旋光性和旋光角度与R基团的性质及测定时溶液的pH有关；n 当某氨基酸以等量L、D型混合时，旋光抵消，称外消旋；n 化学合成所得氨基酸为D、L各半的混合物，称DL型，无旋光性，可用化学或生化方法将二型分开，此时才表现出旋光性。（二）氨基酸的种类及结构1、根据是否组成蛋白质来分 非极性R基团氨基酸 （8种）：丙氨酸（Ala） 缬氨酸（Val）亮氨酸（Leu） 异亮氨酸（Ile）脯氨酸（Pro） 苯丙氨酸（Phe色氨酸（Trp） 甲硫氨酸（Met）特点：不易溶于水R基疏水性大小: Ala Met Pro Val Leu Ile Phe Trp这类氨基酸R基的疏水性，在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。Pro是唯一的一种-亚氨基酸，它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用，一般出现在两段-螺旋之间的拐角处. 极性不带电荷R基团氨基酸（7种）：甘氨酸（Gly）丝氨酸（Ser）苏氨酸（Thr）半胱氨酸（Cys）酪氨酸（Tyr） 天冬酰胺（Asn）谷氨酰胺（Gln）特点：侧链含极性基团，在生理条件下不解离，易溶于水，R侧链能与水形成氢键。Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。Cys中R含巯基（-SH），两个Cys的巯基氧化生成二硫键，二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义 CysssCys R基团带负电荷氨基酸：天冬氨酸（Asp）谷氨酸（Glu）在生理条件下,侧链羧基完全解离，带负电荷。为酸性氨基酸 R基团带正电荷氨基酸：赖氨酸（Lys）精氨酸（Arg）氨酸（His）为碱性氨基酸，在生理条件下，侧链解离，带正电荷。4、按人体是否可合成来分：必需氨基酸：Lys Val Ile Leu phe Met Trp Thr 半必需氨基酸：Arg His非必需氨基酸：其余氨基酸5、蛋白质中几种重要的稀有氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。6、非蛋白氨基酸广泛存在于各种细胞和组织中，呈游离或结合态，但并不存在蛋白质中的一类氨基酸，大部也是蛋白质氨基酸的衍生物。结 构 特 点：（1）大多是L-型氨基酸的衍生物，L-瓜氨酸（Cit） 、L-鸟氨酸（Orn）（2）-、-、-氨基酸 -Ala、-氨基丁酸。（3）D-型氨基酸 D-Glu、D-Ala（肽聚糖中） D-Phe（短杆菌肽S非蛋白氨基酸存在的意义：1.作为细菌细胞壁中肽聚糖的组分：D-Glu D-Ala2.作为一些重要代谢物的前体或中间体: b -丙氨酸（VB3）、鸟氨酸（Orn）、胍氨酸（Cit）(尿素)3.作为神经传导的化学物质：-氨基丁酸4.有些氨基酸只作为一种N素的转运和贮藏载体（刀豆氨酸）5.杀虫防御作用:如种子中高浓度的刀豆氨酸和5-羟色氨酸能防止毛虫的危害，高精氨酸能抑制细菌的生长。（三）氨基酸的理化性质1. 氨基酸的一般物理性质 氨基酸的旋光性：除甘氨酸外，氨基酸含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。 旋光性：旋光物质使平面偏振光的偏振面发生旋转的能力。使偏振面向右旋的，称右旋光物质，记为“+”，使偏振面向左旋的，称左旋光物质，记为“-”。氨基酸的旋光性是由它们的结构决定的。除甘氨酸外，其它氨基酸的-C原子都与四个不同的原子和基团连接，因而是不对称C原子。手性中心（chiral center）：当一个C原子有四个不同的取代基同它连接形成一个不对称碳原子时，这个碳原子就是一个不对称中心或称做手性中心。 氨基酸的光吸收构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(97%以上）；b、知道蛋白质的分子量；可以预测AA数目，工作量大小。c、知道蛋白质由几个亚基组成；(2). 测定步骤A.测定蛋白质分子中多肽链的数目和种类。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。B.多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).尿素和盐酸胍与蛋白质的可能作用方式：a.与肽链竞争氢键b.增加非极性侧链在水中的溶解度。C.二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇【SH-CH2-CH2-OH】 (还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。D.分析多肽链的N-末端和C-末端。多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N-端氨基酸分析：Sanger反应、Edman反应、与丹磺酰氯反应、氨肽酶法。C-端氨基酸分析：1、肼解法此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。2、羧肽酶(carboxypeptidase)法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。E.多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽链断裂法：酶解法和化学法。酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶等胰蛋白酶：Trypsin ：R1=Lys和Arg时（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro 水解受抑。糜蛋白酶：或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe, Trp,Tyr时水解快; R1= Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro 水解受抑。胃蛋白酶：Pepsin：R1和R2Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。R1=Pro 水解受抑。嗜热菌蛋白酶：thermolysin：R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。R2=Pro或Gly 水解受抑。R1或R3=Pro 水解受抑。化学法：可获得较大的肽段溴化氰(Cyanogen bromide)水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。F.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。G.确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 H.确定原多肽链中二硫键的位置。采用胃蛋白酶水解：切点多，二硫键稳定。一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换)。将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离。 测定步骤：1.测定蛋白质分子中多肽链的数目2.拆分蛋白质分子中的多肽链3.断裂多肽链内的二硫键4.测定多肽链的氨基酸组成5.分析多肽链的N末端和C末端6.多肽链部分裂解成肽段7.测定各个肽段的氨基酸顺序8.确定肽段在多肽链中的顺序9.确定多肽链中二硫键的位置蛋白质的分类(回顾)：分类原则：按分子形状、分子组成、溶解度、生物功能 按分子形状：球状蛋白和纤维状蛋白； 按分子组成：简单蛋白和结合蛋白； 按溶解度：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白等; 按生物功能：酶、运输蛋白、营养和储存蛋白、运动蛋白、结构蛋白和防御蛋白。纤维状蛋白分子：角蛋白、胶原蛋白、血纤维蛋白、肌纤维蛋白。功能:在生物体内保护、支持、结缔功能。球蛋白分子：血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白、球蛋白、酶蛋白、激素蛋白、抗体等2. 蛋白质的二级结构与纤维状蛋白1) 构型与构象 (1)构型（configuration）：指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。两种构型间的转变需要共价键的断裂和重组。(2)构象（conformation）:指取代原子或基团当单键旋转时可能形成的不同立体结构。这种空间位置的改变不涉及共价键的断裂。 2）蛋白质的构象概念：蛋白质的构象即蛋白质空间结构（高级结构），指蛋白质分子中所有原子和基团在三维空间的排列及肽链的走向。一个蛋白质的多肽链在生物体正常的温度和pH条件下，只有一种或很少几种构象。这种天然构象保证了它的生物学活性，并且相当稳定。这一事实说明了天然蛋白质共价主链上的单键不能自由旋转。 蛋白质多肽链空间折叠的限制因素：Pauling和Corey在利用X-射线衍射技术研究多肽链结构时发现： 1.肽键具有部分双键性质：C-N单键键长0.149nm，C=N双键键长0.127nm肽键键长0.132nm 2.肽键不能自由旋转 3.组成肽键的四个原子和与之相连的两个-碳原子（C）都处于同一个平面内，此刚性结构的平面叫肽平面（peptide plane）或酰胺平面（amide plane).X-射线结晶学分析的三个阶段：分辨率0.6nm 多肽主链的折叠和走向；分辨率0.2nm 可以辨认分子的侧链基团；分辨率0.14nm 识别所有的氨基酸。 3) 蛋白质的二级结构 蛋白质的二级(Secondary)结构是指多肽链的主链本身在空间的排列、或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。氢键是稳定二级结构的主要作用力。 主要有a-螺旋、b-折叠、b-转角、自由回转(无规则卷曲、无规则区域)。(1) a-螺旋（a-helix）及结构特点a. 肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;b. 肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，每个氨基酸残基的C=O氧与其后第四个氨基酸残基的N-H氢形成氢键。c. 蛋白质中的a -螺旋几乎都是右手螺旋。关于a-螺旋的几点说明：a-螺旋是蛋白质中最常见，含量最丰富的二级结构。a-螺旋中每个残基（Ca）的二面角f和y各自取同一数值，即f=-57、 y=-48 。a-螺旋有左手和右手螺旋，蛋白质中的a-螺旋几乎都是右手螺旋。a-螺旋都是由L-型氨基酸构成的（Gly除外）。a-螺旋的形成及其稳定性与其氨基酸组成和顺序有关（Pro、polyLys、PolyHe）。 a-螺旋折叠过程中存在协同性。a-螺旋的书写形式为：3.613-螺旋。(2) b-折叠（b-pleated sheet）b-折叠或b-折叠片也称b-结构或b-构象，它是蛋白质中第二种最常见的二级结构。b-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的多肽链平行排列，通过链间的氢键进行交联而形成的，或一条肽链内的不同肽段间靠氢键而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。b-折叠的特点：b-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链间氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。b-折叠有两种类型：一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边(如,- 角蛋白)。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反(如,丝心蛋白)。（3）- 转角(- turn)链内形成氢键，多肽链出现180的回折。此回折角称- 转角结构。此结构广泛存在球状蛋白中。在b-转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个比较稳定的环状结构。它是一个非重复性结构。（4）自由回转(random coil)（亦称无规则卷曲、自由绕曲,但决非变性蛋白的无规卷曲）有时在球状蛋白分子表面有时在其分子内部指无规律的松散肽链结构。通常酶蛋白包含此构象，蛋白功能的可塑性较大，灵活易变。4） 超二级结构1.超二级结构指蛋白质中相邻的二级结构单位（a-螺旋或b-折叠或b-转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。2.超二级结构的基本类型：aa、 bab、bbb（1） aa由两股或三股右手螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋。（2） bab由两段平行的b折叠股和一段连接链（或是a螺旋、或是无规则卷曲)组成。（3）bbb由若干段反平行的b折叠股组合而成，两个b折叠股间由一个短环连接起来。纤维状蛋白 ： 纤维状蛋白质(fibrous protein)广泛地分布于脊椎和无脊椎动物体内，它是动物体的基本支架和外表保护成分，占脊椎动物体内蛋白质总量的一半或一半以上。这类蛋白质外形呈纤维状或细棒状，分子轴比(长轴短轴)大于10(小于10的为球状蛋白质)。分子是有规则的线型结构，这与其多肽链的有规则二级结构有关，而有规则的线型二级结构是它们的氨基酸顺序的规则性反映。5) 结构域（domain）结构域：指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上，进一步卷曲、折叠形成几个相对独立、近似球形的三维实体。结构域这一折叠层次的出现不是偶然的：具有结构上的意义;具有功能上的意义.3. 蛋白质的三级结构1) 蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指多肽链在二级结构、超二级结构、结构域的基础上，进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维分子结构。2) 维持三级结构的作用力氢键（主链内部、侧链之间、侧链与主链、侧链与介质水、主链与介质水）；范德华力；疏水相互作用-疏水效应（疏水键）在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部。这一现象称为疏水相互作用；离子键（盐键）；二硫键；疏水相互作用，在蛋白质三级结构中起着重要作用，它是使蛋白质多肽链进行折叠的主要驱动力。4. 蛋白质的四级结构亚基：几条肽链以非共价键联结成一稳定的活性单位，这种肽链称该蛋白质的亚基(subunit)。四级结构：亚基间通过非共价键聚合而成的特定结构。寡聚蛋白质：有两个或多个亚基组成的蛋白质统称寡聚蛋白质或多体蛋白质。维持蛋白质四级结构的主要作用力：氢键、离子键、范德华力、疏水相互作用和二硫键。即亚基之间主要通过次级键彼此缔合在一起；疏水相互作用是最主要的作用力。五、蛋白质分子结构与功能的关系(一) 蛋白质一级结构与功能的关系1.同功蛋白质一级结构的种属差异性 细胞色素C是真核细胞线粒体内膜上一种含Fe的蛋白质在生物氧化中起传递电子的作用。通过植物、动物、微生物等数百种生物的细胞色素C一级结构的研究表明： （1）亲缘关系越近，AA顺序的同源性越大。 不同生物与人的细胞色素C相比较AA差异数目 黑猩猩 0 鸡、火鸡 13 牛猪羊 10 海龟 15 狗驴 11 小麦 35 粗糙链孢霉43 酵母菌 44 （2）尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素C功能密切相关的AA顺序却有共同之处，即保守顺序不变。cytC三维结构的保守性：与血红素定位有关的6个AA不变： 2Cys His Met TyrTrp裂隙处AA保守拐弯处AA保守共计28AA严格保守。2.蛋白质一级结构的变异与分子病分子病指蛋白质分子中由于AA排列顺序与正常蛋白质不同而发生的一种遗传病。镰刀状细胞贫血病：病人体内血红蛋白的含量乃至红细胞的量都较正常人少，且红细胞的形状为新月形，即镰刀状。此种细胞脆性大，极易涨破而发生溶血；再者，发生镰变的细胞粘滞加大，易栓塞血管；由于流速较慢，输氧机能降低，使脏器官供血出现障碍，从而引起头昏、胸闷而导致死亡。病因：血红蛋白AA顺序的细微变化，常人HbAbN6Glu，人 HbSbN6Val。正常人的HbA的链第六位是Glu，而病人（HbS)则被Val取代（遗传密码由CTTCAT)。每种蛋白质分子都具有特定的结构来行使特定的功能，即使是一级结构个别AA的变化也能引起功能的改变或丧失。-链 1 2 3 4 5 6 7 8Hb-A N- Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-LysHb-S N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys 由此引起三级结构多一疏水键，四级结构发生线性缔合，导致红细胞发生溶血。3.一级结构的局部断裂与蛋白质的激活胰凝乳蛋白酶原（proenzyme）的激活:酶的无活性前体叫酶原；由酶原变成有活性酶的过程叫酶原激活。 胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶原A 链 + B 链（245AA残基）（1-15）（16-245） Ser14-Arg15 p-胰凝乳蛋白酶 Thr147-Asn148注意：单一肽键断裂的意义 C 链 + D 链 + E 链 （1-13） （ 16-146 ） （ 149-245） 胰凝乳蛋白酶（二）蛋白质高级(构象)与功能的关系1. 肌红蛋白的结构与功能（1）肌红蛋白的功能：哺乳动物肌肉中储存氧并运输氧的蛋白。（2）肌红蛋白的结构特点：1963Kendrew a .一条多肽链，153个氨基酸残基，一个血红素辅基，分子量17600。 b.肌红蛋白的整个分子具有外圆中空的不对称结构，肽链共折叠成8段较直的a -螺旋体（ 75%， A-H），最长的有23个氨基酸残基，最短的有7个氨基酸残基。拐弯处多由Pro、Ser、Ile、Thr等组成。 c.具有极性侧链的氨基酸残基分布于分子表面，而带非极性侧链的氨基酸残基多分布于分子内部，使肌红蛋白成为可溶性蛋白。2.血红蛋白的结构与功能（1）血红蛋白的功能：存在动物血液的红细胞中，具有运输O2和CO2的功能；血红蛋白还能和H+结合，从而可以维持体内pH值.（2）血红蛋白的结构特点：a.是四个亚基的寡聚蛋白，574个AA残基，分子量65000b.成人的血红蛋白为a2b2（HbA-96%）、a2d2（ HbA2-2%）胎儿的血红蛋白为a2g2（HbF）c. a 链由141AA残基组成， b d g 链由146AA残基组成。四种肽链的三级结构与肌红蛋白相似，各自内部有一个血红素辅基。(3)氧合引起血红蛋白的构象变化A. 几个概念别构蛋白:蛋白质分子中不止有一个配基的结合部位（活性部位），还有别的配基的结合部位（别构部位）。别构蛋白都有别构效应。别构效应:蛋白质与配基结合后改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质的生物活性的现象。别构蛋白的结构特点:都是寡聚蛋白质，有四级结构.分子中每个亚基上都有活性部位，或者还有别构部位；某些蛋白质的活性部位和别构部位分属不同的亚基。不同亚基各部位之间存在相互作用，部位之间的影响是通过构象变化传递的.b. 与氧结合时血红蛋白的变构过程血红素中铁原子的变化 高自旋状态 低自旋（非氧合，原子半径较大） （氧合，原子半径较小）C. H+、CO2和DPG 对血红蛋白结合氧的影响H+、CO2的影响: 1914年，C.Bohr发现，高浓度的H+和CO2促使氧合血红蛋白分子释放O2，而高浓度的O2促使脱氧血红蛋白分子释放H+和CO2。血红蛋白对O2、 H+和CO2结合的这种相互关系叫波耳效应。波耳效应的生理意义 肌肉pH7.2H+HbO2 +H+ +CO2Hb+ O2 肺泡pH7.6CO2DPG的影响：DPG和O2对血红蛋白的结合是排斥的。DPG降低血红蛋白亲氧能力的重要生理意义： DPG是红细胞中存在的糖代谢中间产物。当血液流经O2分压较低的组织时，红细胞中的DPG可促进氧合血红蛋白释放氧，以满足组织对O2需要。 DPG浓度越大， O2的释放量越多。红细胞中DPG浓度的变化是调节血红蛋白对氧亲和力的重要因素。实例：在高山上；肺气肿病人；储藏血液（用肌苷代替酸性柠檬酸葡萄糖）。d.血红蛋白S形氧合曲线的生理意义：S形氧合曲线反映了血红蛋白对于O2的结合与解离存在协同作用。使血红蛋白更有效地担负输送氧的任务。煤气中毒的机制：一氧化碳（CO）也能与血红素Fe原子结合。由于CO与血红素的结合能力是O2的200倍(单独时是25000倍)，因此，人体吸入少量的CO即可完全抑制肌红蛋白或血红蛋白与O2的结合，从而造成缺氧死亡。急救方法是尽快将病人转移到富含O2的环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧气），使与血红素结合的CO被O2置换出来。 3. 蛋白质构象改变，活性丧失。用化学方法修改蛋白质或多肽化合物的结构，可提高活性；了解蛋白质结构中的活性必需片段，可人工合成蛋白质。六、蛋白质的重要性质1. 蛋白质的两性解离和电泳现象蛋白质与多肽一样，能够发生两性解离，也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)带电粒子在电场中移动的现象。蛋白质分子中可解离的基团主要来自aa残基的侧链R基 如：-羧基、-羧基、-氨基、咪唑基、胍基;此外还有蛋白质分子末端-氨基和-羧基。在生理条件下，这些基团解离使蛋白质即可作为酸又可作为碱，所以蛋白质也是两性电解质。2.蛋白质的胶体性质由于蛋白质的分子量很大（1-100nm），它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等。3.蛋白质的沉淀作用蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。定义：蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。可逆沉淀：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）使蛋白质沉淀析出的现象.盐溶：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，此现象叫盐溶。有机溶剂沉淀法（脱去水化层、降低介电常数）。在低温下或缩短处理时间可防止或减缓变性）。盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。盐溶作用是由于在盐浓度较低时，盐离子被蛋白质分子吸附，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强了，因而溶解度增加。分段盐析 ：不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如： (NH4)2SO4血清 球蛋白（析出）清蛋白（析出） 50%饱和度饱和不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀（Hg2+、 Pb2+ 、Cu2+、 Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀。（4）蛋白质的变性：天然蛋白质因受物理、化学因素的影响，使蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化。这种现象称为蛋白质的变性(d