8.生物大分子制备技术

第八章生物大分子制备技术1第一节概 述生物大分子主要是指蛋白质、酶和核酸蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功 能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生 物大分子结构与功能的研究，必须首先解决 生物大分子的制备问题。2与化学产品的别离制备相比拟，生物大分子的制备有以下主要特点：1.生物材料的组成极其复杂;2.许多生物大分子在生物材料中的含量微小;3.许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境就极易 失活.(别离过程中如何防止其失活? 难题)4.实验结果常有很大的经验成份，实验的重复性较 差。3生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：确定要制备的生物大分子的目的和要求。建立可靠的分析测定方法掌握生物大分子目的产物的理化性质。生物材料的预处理和细胞破碎。别离纯化方案的选择。生物大分子制备物的均一性纯度的鉴定。产物的浓缩，枯燥和保存。4制备生物大分子的别离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形 状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电 泳、层析、高(超)速离心。5制备的要求1.纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。 如为研究蛋白的结构，要求均一； 工业医药方面应用的酶和蛋白质制剂，到达一定纯度即可，不要求均一。2.活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的 生物活性。3.收率：希望收率越高越好，但在别离纯化过程中 总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。6第二节 材料的选择与预处理一、材料的选择1.主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、制备 工艺简单、本钱低的动植物组织或微生物做原料。 科研选材那么无需考虑上述问题，只要能到达实验目的即可。72. 实验材料选定后，常需要进行预处理如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组 织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将 菌体与发酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工 处理。假设不立即进行实验或加工，应冷冻保存。8二、 细胞的破碎及细胞器的别离别离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出 来，并保持原来的天然状态，不失生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但假设材料是体液如血或生物体分泌到体外 的分泌物，那么不必进行组织细胞的破碎。9组织细胞的破碎方法 p130不同的实验材料使用不同的破碎方法。动物组织和细胞：可用电动捣碎机或匀浆器 破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞：由于具有细胞壁，一般常 用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法 破碎或用纤维素酶处理也能到达目的。10细菌细胞的破碎：比拟困难，因为整个细菌细胞壁的骨架是共价键连接而成的肽聚糖大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理以分解肽聚糖。反复冻融法自溶法溶胀法有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶 性溶剂外表活性剂处理细胞:SDS等11细胞器的别离 各类生物大分子在细胞内分布是不同的，要根据 目的物质的位置来选择材料细胞器。 如果要别离制备分布在细胞器中的生物大分子， 为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰 或污染，还需先将细胞器别离出来，然后在某一 细胞器中别离某一物质。1314细胞器的别离一般采用差速离心法，即将破碎后的 细胞在适当的介质中进行离心。线粒体第三节生物大分子的提取与纯化生物大分子：蛋白质、核酸、糖类、脂类等提取：组织细胞破碎后，大量的细胞内含物被释 放出来，将其置于一定条件下和溶剂中，让制 备物充分溶解。固相液相15一、生物大分子的提取以蛋白质为例一水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。1. 温度：一般采用低温5度以下操作。2. 为了防止蛋白质降解，可参加蛋白水解酶抑制剂如二异丙 基氟磷酸，碘乙酸等。3. 提取液的pH值和盐浓度。 提取液的pH值应选择在偏离等电点的pH 范围， 通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50m mol/L的磷酸盐缓冲液或L Tris-HCl缓冲液作提取液。16二有机溶剂提取法提取脂蛋白、脂溶性大分子 一些和脂质结合比拟牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀 碱，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取，它们具有一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂 蛋白的提取液。必须在低温下操作。17二、蛋白质的别离纯化p142蛋白质别离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷，亲和性等建立起来的。常用的别离纯化技术有： 沉淀法 膜别离 离心 吸附层析、凝胶层析、离子交换层析、亲和层析 电泳18一根据蛋白质溶解度不同的别离方法沉淀法1. 盐析盐析法：当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸 镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，pH常在19z盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，原 来溶液中大局部的自由水转变为盐离子的水化水，破坏蛋白质分 子外表的水化层。盐离子中和了蛋白质电荷，破坏了亲水胶体20分段盐析z不同的蛋白质分子，由于其分子外表的极性基团 的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不 同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋 白质中的盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。 如：(NH4)2SO4血清球蛋白清蛋白50%饱和度析出饱和析出21常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶解度大，价格廉价，浓度高时也不会 引起蛋白质活性丧失。盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活 性。蛋白质用盐析方法沉淀别离后，还需要脱盐才能 进一步精提纯。脱盐常用透析法。透析是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透膜制 的透析袋里放在蒸馏水中进行，可不断更换蒸馏水，直至杂质被除去。透析袋 蛋白质溶液蒸馏水222. 有机溶剂沉淀法与水混溶的有机溶剂：甲醇，乙醇或丙酮等，可 使多数蛋白质溶解度降低并析出，但蛋白质较易 变性，应在低温下进行。有机溶剂引起蛋白质沉淀的原因有两个： 降低水的介电常数，使蛋白质分子外表可解离基 团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋 白质分子的聚集沉淀。 极性有机溶剂与蛋白质争夺水化层，而使蛋白质 分子沉淀。233.等电点沉淀蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数 量有关。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋 白质的溶解度最小。不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节 溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与 其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。4.选择性变性沉淀热变性、酸碱变性、有机溶剂变性5.结晶24二根据蛋白质分子大小的差异的别离方法1、透析与超滤 膜别离 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。2526超滤法：利用高压力或离心力，迫使水和其他小的 溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可 选择不同孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白 质。前景很好2、凝胶过滤法也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大 小别离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶Sephadex 和琼脂糖凝胶agarose 。3、离心4、SDS-PAGE电泳2728三根据蛋白质带电性质进行别离蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同1、电泳法 各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳。EttanTM IPGphor II 双向电泳专用等电聚焦电泳系统292、离子交换层析法离子交换剂有阳离子交换剂如CM-纤维素和阴离子 交换剂DEAE纤维素，当被别离的蛋白质溶液流经离 子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸 附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度方法将吸附 的蛋白质洗脱下来。四根据配体特异性的别离方法亲和层析法亲和层析法是别离蛋白质的一种极为有效的方法， 根据某些蛋白质与配体(Ligand能特异而非共价地结 合而别离。3031无法用单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，往往 采取几种方法联合使用。32三、核酸的提取与纯化一核酸的提取DNA和RNA在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的 形式存在。DNA的提取：一般是利用DNA-核蛋白DNP易溶 于高盐溶液1mol/L NaCl而不溶于低盐溶液L NaCl。RNA的提取：利用RNA-核蛋白RNP易溶于低盐 溶液L NaCl而不溶于高盐溶液1mol/L NaCl的性质，先提取得到RNP。提取得到DNP或RNP后，再将蛋白质除去即可得到 相应的核酸。33二蛋白质的去除蛋白质的去除可以选择去污剂法或有机溶剂法。去污剂法：利用SDS等阴离子去污剂与蛋白质的侧 链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后参加浓醋 酸钾溶液，使SDS-蛋白质复合物沉淀。有机溶剂法：利用酚氯仿的混合液作蛋白质的变 性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇 时形成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而变 性，与核酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水相，下层为 有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。最后利用乙醇或异 丙醇使核酸沉淀离心收集即可。34考前须知1. DNA的提取 不同的材料，提取方法略有不同； 最后DNA制品中的RNA可用Rnase水解除去。2. RNA的提取 防止RNA降解，异硫氰酸胍法提取总RNA。 rRNA、tRNA、mRNA分开方法：差速离心，分开细胞器；根据mRNA的polyA尾巴，用oligodT层析柱纯化。35三核酸的纯化去除蛋白，酚/氯仿抽提精提纯，常用超离心、电泳、柱层析等方法。四核酸的浓缩乙醇沉淀法、异丙醇沉淀法36五DNA、RNA的定量1、紫外分光光度法要求是较纯的样品。 测OD260、OD2801 OD260 50 g/mL 双链DNA 40 g/mL 单链DNA或RNA 20 g/mL 单链寡核苷酸OD260/OD280判断核酸纯度： 纯DNAOD260/OD280 1.8 纯RNAOD260/OD280 假设有蛋白质、酚类污染，那么明显降低2、荧光定量电泳EB染色37四、 纯度鉴定生物大分子经过别离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。 蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离 心沉降分析法、层析等。 纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速 度移动，它的电泳图谱只出现一条带，层析、 HPLC、毛细管电泳都是一个峰。3839第四节 浓缩、枯燥及保存一、样品的浓缩生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变 得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓 缩。常用的浓缩方法的：1、减压加温蒸发浓缩 通过降低液面压力使液体沸点降低，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。40旋转蒸发器2、空气流动蒸发浓缩3、冰冻法 低温结冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中414、吸收法常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙烯吡咯酮、蔗糖和凝 胶等5、超滤法使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的 方法，液体在一定压力下通过膜时，溶剂和小分子透过，大分 子受阻保存。最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱 盐。优点：本钱低，操作方便，条件温和，能较好地保持 生物大分子的活性，回收率高等。42二、枯燥生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要枯燥处理。1、真空枯燥 适用于不耐高温，易于氧化物质的枯燥和保存，整个装置包括枯燥器、冷凝器及真空泵。44452、真空冷冻枯燥在真空枯燥根底上，增加了温度因素。在低温 低压下，冰易升华为气体。操作时先将待枯燥的 液体冷冻变成固体，然后 在低温低压下将溶剂变成 气体而除去。此法干后的产品具有 疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于生物大分子的枯燥保存。三、贮存一枯燥的制品一般比拟稳定，贮藏要求简单，只要将枯燥的样品置于枯燥器内密封，保持04度冰箱即可。二液态贮藏时应注意以下几点：1、样品不能太稀，必须浓缩，样品太稀易使生物 大分子变性。462、一般需参加防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。稳定 剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等。核酸大分子一般保存在氯 化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。3、贮藏温度要低，0度以下冰箱保存，有的那么要 求更低，应视不同物质而定。47下周实验三：植物基因组DNA的提取与电泳检测 参见 p187地点：2074.28上午35节 食品1班 下午13节 食品2班48