地高辛标记系统

探针的标记地高辛标记系统常用标记物分类n放射性同位素标记n非放射性标记荧光素标记生物素标记地高辛标记n地高辛（DIG）是灵敏度高、非放射性核酸标记检测体系。DIG检测灵敏度接近同位素而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备，相比生物素则没有样本内源干扰之苦，很适合用于核酸非放标记检测。 地高辛标记的dUTP地高辛标记系统的特点n标记和检测技术安全n标记的探针稳定可以保存一年n杂交液可以反复使用数次与放射性同位素标记方法相同之处n标记和杂交技术相似n高灵敏度n低背景n可以标记DNA、RNA 或Oligonucleotides与放射性同位素标记方法不同之处n无害,安全n产生的废物不需特殊处理n需要分析的时间短n探针稳定地高辛标记与检测的原理n利用不同的方法将Digoxigenin-11-dUTP掺入到新合成的探针DNA 或RNA链中或寡核苷酸的末端n探针与目标DNA杂交后，用连接有碱性磷酸酶或其它偶联物的地高辛的抗体检测地高辛标记的探针n根据地高辛抗体连接的偶合物不同，利用荧光检测（anti-DIG-fluorescein，rhodamine)、化学发光检测(anti-DIG-AP and CSPD or CPD-star)或显色（anti-DIG-AP and NBT/BCIP or other substrates)的方法将探针杂交的位置显现出来n利用随机引物标记的方法将 Digoxigenin-11-dUTP掺入到新合成的DNA 链中。n反应体系中包含六碱基随机引物、dNTP(含有碱性条件下不稳定的Digoxigenin-11-dUTP，Klenow 酶及反应所需的Buffer随机引物标记nDIG-dUTP:dTTP的理想比例1：3n20-25bp 可插入一个DIG-dUTPn随机引物法标记的探针是基于模板的不同区段、不同长度的DNA 片段n可以探测0.03-0.1pgDNADNA的地高辛标记和检测步骤n探针DNA 的标记及标记效率测定nDNA的转移和固定n杂交n免疫测定n洗去膜上探针再次杂交操作基本要求n工作环境及试剂要干净：（1）试剂要高压灭菌；（2）含有SDS 的试剂要过滤灭菌；（3）TWEEN20应加到预先灭菌过的试剂中n用具要干净：用之前一定要清洗得非常干净n操作尼龙膜时要小心（1）戴无尘手套；（2）用干净的镊子夹取膜的边缘探针模板DNA的要求n质粒DNA纯度要高。最好用高纯度的质粒DNA 分离和纯化试剂盒纯化质粒模板或用苯酚/氯仿抽提去除残留的蛋白质。纯化后的模板用H2O 溶解n用作探针模板的DNA应是线型的，大于100bp，如果模板DNA 5kb则应用4碱基的限制性内切酶切割成较小片段（切割后要纯化）n模板的量：10ng-3g，如果要检测复杂基因组中的单拷贝基因，标记模板的最低量要300ng（探针浓度：25ng/ml杂交液）n如果做基因组DNA southern blotting, 应将克隆倒载体上的DNA 酶切后琼脂糖电泳分离或PCR扩增，得到的片段都需要用试剂盒纯化标记步骤(20l)n将10ng-1g 模板DNA用无菌去离子水补足至16 l。n沸水浴或干浴98 C 10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。n充分混匀DiG-high Primer （1#管），并取4 l至变性DNA管，混匀并离心。n37 C温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。n停止反应，加2 l 0.2M EDTA（pH 8.0）或65 C加热10分钟。本次实验标记步骤(10l)n将300ng 模板DNA用无菌去离子水补足至8 l。n沸水浴或干浴98 C 10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。n充分混匀DiG-high Primer （1#管），并取2 l至变性DNA管，混匀并离心。n37 C温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。n停止反应，65 C加热10分钟。探针标记效率检测n目的是确定杂交中使用正确的探针量，探针用量太多会引起背景太深，用量太少则无杂交或杂交很弱（探针浓度：25ng/ml杂交液）检测流程n将地高辛标记好的探针系列稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120C固定30分钟；n用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；n比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。试剂准备（1）nWashing buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; pH 7.5(20); 0.3%(v/v) Tween20. 15-25 stable. Removal of unbound antibody.nMaleic acid buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; adjust with NaOH(solid) to pH 7.5(20)0 15-25 stable. Dilution of Blocking solution.nDetection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5(20). 15-25 stable. Ajustment of pH to 9.5. nTE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0. 15-25 stable. Stopping color reaction.试剂准备（2）nBlocking solution :用Maleic acid buffer 10稀释试剂6#（10Blocking solution ），成1的工作液，即每9ml Maleic acid buffer中加入1ml 10Blocking solution 混匀，现配现用。封闭膜上非特异性结合位点nAntibody solution(Ab) solution : 将4#试剂离心，按1：5000或1：10000加入Blocking solution，2-8 C可放12小时。（每10ml Blocking solution 加1ul Ab抗体即可）.与地高辛标记的探针结合。nColor-substrate solution（显色液）：从试剂5#(NBT/BCIP)中取100ul到5ml Detection buffer，要避光，现配现用。显示抗体结合的位点Dig-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下标记产量Template DNA1 h20 h10 ng45 ng600 ng30 ng130 ng1050 ng100 ng270 ng1500 ng300 ng450 ng2000 ng1000 ng 850 ng2300 ng3000 ng1350 ng2650 ng探针定量n根据上表探针标记的理想产量将标记的探针稀释到1ng/l. 例如：起始模板用1g，20l体系1h 后，查前表可知其理想标记量是850ng，则探针的理想标记浓度为850ng/20 l =42.5ng/l; 则取1l标记产物+41.5l H2O 混匀后即得到1ng/l探针稀释液. n将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/l (原始浓度是5ng /l)Tube From tube#DNA (l)DNA dilution buffer(l)Dilution Final concentration1Diluted orginal1ng/l2121981:10010 pg/l3215351:3.33 pg/l425451:101 pg/l535451:100.3 pg/l645451:100.1 pg/l755451:100.03 pg/l865451:100.01 pg/l步骤n将上述稀释的2-9 号管的control DNA 及探针DNA各取1l点膜n120C固定30分钟或紫外交链n将膜放入装有20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室温2分钟n将膜放入10ml Blocking solution中室温温育30分钟n将膜放入10ml Antibody solution 中室温温育30分钟n用10ml Washing buffer 洗2次，每次15分钟n在10ml Detection buffer 平衡2-5分钟n将膜放入2ml 新配制的Color substrate solution 中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动。n当斑点或带显示出来后，用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟，照相定量结果分析染色至0.1pg的Control DNA出现斑点，比较标记的探针与Control DNA 染色情况计算出地高辛标记的DNA 的量。u如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想u如果0.1pg的对照显色， 0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多少探针（25ng探针/ml杂交液）u如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则应重新标记探针探针标记效率低的原因及解决办法1. 标记条件不合适u重新标记，但将标记时间延长至过夜u用相同量的模板标记，但体系放大，体系中的其它成分相应放大u模板放在沸水中变性2. 模板不纯只用高纯度模板用推荐的试剂盒准备模板纯化模板：用苯酚/氯仿抽提后用酒精沉淀DNA 的转移和固定n固定：2 的SSC短暂洗涤膜后 120C 30 min 或80C 2h；或者将膜放在用10 的SSC 浸湿的滤纸中UV-Crosslinkeringn不马上使用的尼龙膜放在2-8 C干燥保存预杂交注意事项n预杂交的目的是用非特异性DNA分子（鲑精DNA）及其它高分子化合物（封闭剂）将待杂交膜中的非特异性位点封闭，从而减少杂交背景。n预杂交及杂交时保证buffer覆盖膜n如果尼龙膜要多次探测，务必保证在任何时候都不要让尼龙膜干燥杂交液组成杂交液组成5SSC (NaCl，柠檬酸钠，柠檬酸钠)50mM PB (NaH2PO4，Na2HPO4)5Denhardt (多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，BSA)2.5mmEDTA （有（有/无）无）100ug/ml SS DNA (鲑精鲑精DNA)0.1%SDS10%硫酸葡聚糖（硫酸葡聚糖（dextran sulfate）杂交液的准备和杂交温度的计算nDiG Easy Hyb：将64ml 无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶（DiG Easy Hyb Granules)，37 C摇动溶解5分钟n计算杂交温度：通常为37 C -42 CnTm=49.82+0.41(%G+C)- (600/I)(I=length of hybrid in base pairs)。nTopt.=Tm-20 to 25 C杂交n预热一定体积的DiG Easy Hyb（10ml/100cm2膜）至杂交温度37-42 C 。n预杂交30分钟。在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液中42 C下充分润湿。（此过程可以延长至数小时）n变性：Dig标记的探针（约25ng/ml）加50l H2O置沸水浴或98 C干浴锅中5分钟后迅速放在冰上冷却。（不能用碱变性！）n将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2）中，混匀，避免泡沫。n倒出预杂交液，加入探针和DIG Easy Hyb混合液。n继续在42 C下杂交6h 至过夜（单拷贝探针）。备注：n含有探针的DiG Easy Hyb杂交液可重复利用，杂交结束后放入离心管中于-20 C保存，可重复使用几次，只需在使用前于68 C处理10分钟即可n不要煮沸DiG Easy Hyb杂交液杂交时注意事项n使用正确的杂交温度（使用DIG EasyHyb，DNA：DNA3742C，RNA：RNA 68C，RNA：DNA 50C）n为防止尼龙膜干燥，在准备好下一步处理用试剂之前不要倒掉正在用的溶液n使用合适的探针浓度n探针用之前68C 变性洗膜n2SSC，0.1%SDS室温下洗涤5分钟，洗2次。n0.5SSC，0.1%SDS 65-68温和摇动15分钟，洗2次。杂交后洗膜时注意事项n如果探针与靶DNA 的同源性低于80%，热洗时应使用较低的温度（如60C）n热洗之前应将洗膜液预热到热洗所需温度免疫检测n试剂准备同探针标记效率测定n所有反应在15-25C进行并轻轻摇动，n如果膜需再次使用，任何时候都不要让膜干燥试剂准备（1）nWashing buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; pH 7.5(20); 0.3%(v/v) Tween20. 15-25 stable. Removal of unbound antibody.nMaleic acid buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; adjust with NaOH(solid) to pH 7.5(20)0 15-25 stable. Dilution of Blocking solution.nDetection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5(20). 15-25 stable. Ajustment of pH to 9.5. nTE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0. 15-25 stable. Stopping color reaction.试剂准备（2）nBlocking solution :用Maleic acid buffer 10稀释试剂6#（10Blocking solution ），成1的工作液，即每9ml 1Maleic acid buffer中加入1ml 10Blocking solution 混匀，现配现用。封闭膜上非特异性结合位点nAntibody solution(Ab) solution : 将4#试剂(Anti-Digoxigenin-AP Conjugate)离心，按1：5000或1：10000加入Blocking solution，2-8 C可放12小时。（每10ml 1Blocking solution 加1ul Ab抗体即可）.与地高辛标记的探针结合。nColor-substrate solution（显色液）：从试剂5#(NBT/BCIP)中取100ul到5ml Detection buffer，要避光，现配现用。显示抗体结合的位点操作步骤（室温下进行）n1杂交和洗膜后，用Washing Buffer( Buffer1)浸泡1-5分钟n2在50-100ml 1Block solution（Buffer2）中处理30分钟n3用1Block solution（Buffer2）稀释抗体DIG-抗原偶联物至150mU/ml（1:5000）n4用20ml antibody solution处理膜30分钟n5用50-100ml Washing Buffer( Buffer1)洗膜15分钟，洗2次n6在20ml detection buffer（Buffer3）中平衡2-5分钟n7在10ml 新鲜配制的color substrate solution中处理膜5分钟，放在塑料袋或盒中，保持黑暗中。注意不要在显色过程中摇动(颜色沉淀在几分钟内开始出现，在16小时内完成显色反应，在显色过程中膜可在光亮处短暂暴露几次)n9当预期的斑点出现时，可在50ml水中洗膜5分钟中止反应。n10结果照像。膜上探针的洗去n将Dimethylformamid (DMF)加入玻璃烧杯中，在在通风柜上的水浴锅中加热到50-60Cn将膜放入预热的DMF 中至蓝色沉淀从膜上消失（注意：DMF 易挥发，在高于67C时能燃烧）n用0.2MNaOH, 0.1%SDS 37C 洗215minn2SSC 平衡后保存n再次与杂交、杂交Trouble shooting n灵敏度低n背景深灵敏度低可能原因解决办法探针没有标记好检测标记效率。放大标记反应体系，延长标记时间至过夜反应纯化模板DNA模板DNA要小于5KB，大片段用限制性内切酶切割标记前要确保模板DNA 变性成为单链杂交的探针DNA 量少增加探针浓度，但不要超过 25ng 探针DNA/ml杂交液； 检查杂交条件和洗膜的条件。延长杂交时间延长显色时间至16 h背景高可能原因解决办法样品中靶DNA 浓度太高Southern 在杂交中植物基因组DNA 不要超过10 ug，质粒DNA 不要超过1ng.探针浓度太高降低探针浓度杂交不好重新计算杂交温度预杂交和杂交中间不要让膜干了用杂交袋杂交时要赶气泡用的尼龙膜型号不对一些型号的尼龙膜易引起高背景加抗体之前封闭不够延长封闭时间和洗涤步骤洗涤不充分检查洗膜的温度和严谨度，热洗前先将洗膜液预热到需要的温度免疫分析过程引入的背景免疫分析用的盘子及其它用品一定要洗的非常干净，抗原抗体结合与显色反应要放到不同的盘子中进行