血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳

实验二 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳电泳一、实验目的一、实验目的1.1.了解电泳的基本原理；了解电泳的基本原理；2.2.掌握电泳分离蛋白质的原理；掌握电泳分离蛋白质的原理；3.3.掌握醋酸纤维素薄膜电泳的方法。掌握醋酸纤维素薄膜电泳的方法。二、实验原理二、实验原理1.1.电泳的基本原理电泳的基本原理 电泳电泳是带电质点在电场力作用下发生定是带电质点在电场力作用下发生定向移动的现象。向移动的现象。 电泳技术电泳技术是利用电泳现象进行物质分离、是利用电泳现象进行物质分离、纯化及鉴定的技术。纯化及鉴定的技术。电泳速度的方向：电泳速度的方向：电泳速度的大小电泳速度的大小：V =QE6 RQR 正正极极负负极极F FF= F 电场力电场力 F=QEF=QE 摩擦力摩擦力 F F = = 6 6 R RV VQE= 6 RV运动速度运动速度2.2.电泳分离蛋白质的原理电泳分离蛋白质的原理蛋白质的两性电离和等电点：蛋白质的两性电离和等电点：等电点等电点 即即 pI pI ( isoelectric point )，当氨基酸酸当氨基酸酸碱电离的速度相等时，即当蛋白质所带净电荷为零，呈电中碱电离的速度相等时，即当蛋白质所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液的性，此时溶液的pH就是此蛋白质的等电点就是此蛋白质的等电点PI。COOHNH3 +ProCOONH3 +ProCOONH2 PropH pH pI碱性碱性电离电离酸性电离酸性电离 v当当pH=PIpH=PI时，所带电荷为时，所带电荷为0 0，粒子是静止的；，粒子是静止的；v当当pHPIpHPI时，酸性电离，释放氢离子，带负电，运动方向是时，酸性电离，释放氢离子，带负电，运动方向是从负极向正极移动；从负极向正极移动；v当当pHPIpHPI时，碱性电离，结合氢离子，带正电，运动方向是时，碱性电离，结合氢离子，带正电，运动方向是从正极向负极移动；从正极向负极移动；v当当pHpH距离距离PIPI越远时，所带电量越多。越远时，所带电量越多。 血清蛋白质的等电点为血清蛋白质的等电点为4.84.87.57.5，均低于，均低于8.68.6，因此电泳，因此电泳时常采用时常采用pH8.6pH8.6的缓冲液。此时，蛋白质解离带负电荷，在的缓冲液。此时，蛋白质解离带负电荷，在电场中向正极移动。电场中向正极移动。由于各种血清蛋白的等电点不同，在同由于各种血清蛋白的等电点不同，在同一一pH下带的电荷数也不同，加上各蛋白质的分子大小也有下带的电荷数也不同，加上各蛋白质的分子大小也有差别，因此在电场中的移动速度不同。带电荷多、相对分子差别，因此在电场中的移动速度不同。带电荷多、相对分子量小的蛋白质泳动较快，带电荷少、相对分子量大的泳动较量小的蛋白质泳动较快，带电荷少、相对分子量大的泳动较慢。这样各种血清蛋白质在同一时间内泳动的距离就不同，慢。这样各种血清蛋白质在同一时间内泳动的距离就不同，从而可将血清蛋白分离成数条区带。从而可将血清蛋白分离成数条区带。3.3.醋纤膜分离血清蛋白质的原理醋纤膜分离血清蛋白质的原理 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳是是采用采用醋酸纤维素薄膜作支醋酸纤维素薄膜作支持物的一种电泳持物的一种电泳技术技术。 醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，具有均一的泡沫状结构，渗透性强，维素醋酸酯，具有均一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动阻力小，用它做区带电泳的支持物，用对分子移动阻力小，用它做区带电泳的支持物，用样量少，分离清晰，对染料无吸附作用，应用范围样量少，分离清晰，对染料无吸附作用，应用范围广广，快速简便快速简便 , ,且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析，溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析，因此目前被广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、因此目前被广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。醋纤膜分离血清蛋白质的方法醋纤膜分离血清蛋白质的方法 以醋酸纤维素薄膜作为支持介质，于薄膜一端加以醋酸纤维素薄膜作为支持介质，于薄膜一端加微量血清，膜两端连接于缓冲液。电泳分离后再经微量血清，膜两端连接于缓冲液。电泳分离后再经染色处理，可将血清蛋白质分成五条主要的区带，染色处理，可将血清蛋白质分成五条主要的区带，从正极依次为从正极依次为清蛋白（清蛋白（Albumin)Albumin)、1-1-球蛋白、球蛋白、2-2-球蛋白、球蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白球蛋白。染料与蛋白。染料与蛋白质的结合是与蛋白质的量成正比，可将各条带分别质的结合是与蛋白质的量成正比，可将各条带分别溶于碱性溶液再进行比色测定，或用一定的有机溶溶于碱性溶液再进行比色测定，或用一定的有机溶剂是薄膜透明化后直接用光密度扫描，从而计算出剂是薄膜透明化后直接用光密度扫描，从而计算出血清蛋白质的含量。血清蛋白质的含量。三、主要试剂与器材：三、主要试剂与器材：v试剂：血清试剂：血清 巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液 染色液，漂洗液染色液，漂洗液v器材：电泳仪，电泳槽器材：电泳仪，电泳槽 醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜（2 28cm8cm） 血清加样器血清加样器四、操作四、操作步骤步骤：1.1.浸膜：将裁好的醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中，浸膜：将裁好的醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中，充分浸透后用镊子取出（约充分浸透后用镊子取出（约20min20min，直到，直到膜上没有膜上没有斑点，中间没有气泡斑点，中间没有气泡为止）。为止）。2.2.点样：点样：毛面向上毛面向上，用点样器，在距膜一端约，用点样器，在距膜一端约1.5cm1.5cm处，与边缘平行直线状点加处，与边缘平行直线状点加35L35L待分离血清。注待分离血清。注意取样适量、均匀；血清线位置适当，粗细均匀，意取样适量、均匀；血清线位置适当，粗细均匀，不能有明显扩散现象。不能有明显扩散现象。 1.5cm3.3.搭桥：首先将双层滤纸铺好，分别放置于电泳槽两搭桥：首先将双层滤纸铺好，分别放置于电泳槽两端，其下端要浸入缓冲液中。然后，将点好样的薄端，其下端要浸入缓冲液中。然后，将点好样的薄膜膜光面向上光面向上平直地贴于电泳槽的支架上。注意桥的平直地贴于电泳槽的支架上。注意桥的方向，方向，点样的一端点样的一端位位于负极于负极，点样线不能搭在滤纸，点样线不能搭在滤纸上。上。醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图4.4.电泳：电泳：红正黑负。红正黑负。 电流电流 2mA/膜膜 。 电泳时间约电泳时间约 50min 50min 。5.5.染色：氨基黑染色：氨基黑10B, 10B, 染色染色2 23min.3min.6.6.脱色：脱色：在在装装有有漂洗液漂洗液的的2 2个漂洗缸个漂洗缸中中，依次，依次漂去多余染料，直到背景漂白为止。漂去多余染料，直到背景漂白为止。五、结果与分析：五、结果与分析：1.1.定性观察：染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。定性观察：染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。2.2.定量测定：光密度仪扫描法，洗脱比色法定量测定：光密度仪扫描法，洗脱比色法六六、临床意义、临床意义 根据电泳图谱，分析每条色带的前后位置、染色深浅及根据电泳图谱，分析每条色带的前后位置、染色深浅及区带宽窄等，可以判定血清蛋白质有无种类及含量的变化，区带宽窄等，可以判定血清蛋白质有无种类及含量的变化，进而帮助诊断疾病。血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上进而帮助诊断疾病。血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上常用于分析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上诊断肝、肾常用于分析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上诊断肝、肾等疾病参考。等疾病参考。1 1、M M蛋白（异常免疫球蛋白）血症：在蛋白（异常免疫球蛋白）血症：在-球蛋白区、球蛋白区、-球蛋白区或两者球蛋白区或两者之间，出现区带细而浓，有时呈波浪状，在光密度计扫描图上呈尖陡高之间，出现区带细而浓，有时呈波浪状，在光密度计扫描图上呈尖陡高峰的峰的M M蛋白带。蛋白带。2 2、蛋白质缺乏症、蛋白质缺乏症3 3、肾病、肾病4 4、急慢性炎症、急慢性炎症5 5、肝病：肝硬化出现、肝病：肝硬化出现“-桥桥” 原发性肝癌在原发性肝癌在AlbAlb与与1-1-球蛋白之间出现一小的区带，称为甲胎球蛋白之间出现一小的区带，称为甲胎蛋白带蛋白带几种疾病的蛋白电泳变化几种疾病的蛋白电泳变化七七、注意事项：、注意事项：1.1.点样点样时时, ,毛面向上毛面向上, ,要求样线粗细均匀，无明要求样线粗细均匀，无明显扩散现象。显扩散现象。2.2.搭桥搭桥时时, ,光面向上光面向上, ,点样端置于负极点样端置于负极, ,样线不样线不能接触滤纸。能接触滤纸。3.3.正确连接导线正确连接导线( (红色红色正极正极，黑色黑色负极负极）。）。4.4.电泳过程中，严禁再取放薄膜。电泳过程中，严禁再取放薄膜。