密度梯度离心法分离操作流程

密度梯度离心法分离PBMC1 .在15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液Ficoll。2 .取5mLs凝静月血与5mL无菌PBSK照1:1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。外周血，PBS淋巴细胞分离液最终体积比为1:1:1。3 .水平离心400gx30分钟。（注意：为保证分离效果，需将离心机升降速率调至最低，即升速为1,降速为0,这样调整后，升降速会比较慢，总体离心时间约为1小时。）4 .离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带（如下图），单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。止匕外，还含有血小板。JS1PBS淋巴细胞分单个核细胞离液红细胞和粒细胞5 .去除部分上层液体（用移液管吸取，不可倾倒），余下约1mL用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一15mL离心管中，加入5倍以上体积的PBS离心300gx10分钟，洗涤细胞两次。6 .末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，可根据情况适量增减时间。7 .加入10mLPBS离心300gx10分钟，洗涤细胞两次。8 .末次离心后，弃上清，加入含有10%FBS勺RPMI1640重悬细胞，计数，计算细胞活力谢谢观赏用本法分离PBMC每1mL全血可分离得到12X106PBMC不同人个体之间存在一定差异。活细胞百分率在95以上。一、/-.、二注意：1. 所有操作都应在无菌条件下进行。2. 在分离前Ficoll和PBSI?试剂土需在37c恒温水浴中预热半小时以上。3. 吸取单个核细胞时不可避免会吸到Ficoll，而Ficoll密度比细胞要大，因此步骤5中需加入足量PBSffi释，若PB琳积太小可能会导致细胞无法离心收集。谢谢观赏