如何构建载体

如何构建载体1启动子的选用和改造外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达 方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的 问题。目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物 均使用CaMV35启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Acti nl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的 发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引 起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时 又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特 异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特 异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异 性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为 在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、 无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表 达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分 重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子 构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将 操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提 高了近10倍（专利）。在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。2增强翻译效率为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容：2.1添加5 -3 -非翻译序列许多实验已经发现，真核基因的 5 -3 -非翻译序列（UTR对基因的正常表达是非常必要的， 该区段的缺失常会导致mRNA勺稳定性和翻译水平显著下降。例如，在烟草花叶病毒（TMV的126kDa 蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由 68bp核苷酸组成的Q元件，这一元件为核糖体提供了新 的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。目前已有许多载体中外源基因的5 -端添加了 Q翻译增强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的3 -端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶 基因的3 -端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。另外，不同基因的3 -端序列增 进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3 -端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的 3 -端序列高60倍。2.2 优化起始密码周边序列虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边 序列。例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUG动，物起始密码子周边序列为CACCAUG原核生物的则与二者差别较大。Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后 对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。例如，有一个细菌的几丁质酶基因，原来的起始密码周边序列为UUUAUGG当被修饰为 ACCAUGG其在烟草中的表达水平提高了 8倍。因此，利用非植物来源的基因构建表达 载体时，应根据植物起始密码子周边序列的特征加以修饰改造。2.3对基因编码区加以改造如果外源基因是来自于原核生物，由于表达机制的差异，这些基因在植物体内往往表达水平很 低，例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，研究发现这 是由于原核基因与植物基因的差异造成了mRN稳定性下降。美国Monsanto公司Perlak等人在不改变毒蛋白氨基酸序列的前提下，对杀虫蛋白基因进行了改造，选用植物偏爱的密码子，增加了 GC含量，去除原序列下影响 mRN稳定的元件，结果在转基因植株中毒蛋白的表达量增加了30100 倍，获得了明显的抗虫效果。3 消除位置效应当外源基因被移人受体植物中之后，它在不同的转基因植株中的表达水平往往有很大差异。这 主要是由于外源基因在受体植物的基因组内插入位点不同造成的。这就是所谓的 位置效应 。为 了消除位置效应，使外源基因都能够整合在植物基因组的转录活跃区，在目前的表达载体构建策 略中通常会考虑到核基质结合区以及定点整合技术的应用。核基质结合区( matrix association region,MAR )是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质 特异结合的DNA序列。一般认为，MAR序列位于转录活跃的DNA环状结构哉的边界，其功能是造成 一种分割作用，使每个转录单元保持相对的独立性，免受周围染色质的影响。有关研究表明，将 MARS于目的基因的两侧，构建成包含 MAR-ge ne-MA结构的植物表达载体，用于遗传转化，能明 显提高目的基因的表达水平，降低不同转基因植株之间目的基因表达水平的差异，减少位置效应。 例如，Allen等人研究了异源MAR(来自酵母)和同源 MAR(来自烟草)对Gus基因在烟草中表达 的影响，发现酵母的MAR能使转基因表达水平平均提高12倍，而烟草本身的MAR能使转基因的表 达水平平均提高60倍。使用来源于鸡溶菌酶基因的 MAR也可起到同样作用。另一可行的途径是采用定点整合技术，这一技术的主要原理是，当转化载体含有与寄主染色体 同源的DNA片段时，外源基因可以通过同源重组定点整合于染色体的特定部位。实际操作时首先 要分离染色体转录活性区域的 DNA片段，然后构建植物表达载体。在微生物的遗传操作中，同源 重组定点整合已成为一项常规技术，在动物中外源基因的定点整合已获得成功，而在植物中除了 叶绿体表达载体可实现定点整合以外，细胞核转化中还很少有成功的报道。4 构建叶绿体表达载体为了克服细胞核转化中经常出现的外源基因表达效率低，位置效应及由于核基因随花粉扩散而带 来的不安全性等问题，近几年出现的一种新兴的遗传转化技术 - 叶绿体转化，正以它的优越性和 发展前景日益为人们所认识并受到重视。到目前为止，已在烟草、水稻、拟南芥、马铃薯和油菜 (侯丙凯等， 等发表) 5 种植物中相继实现了叶绿体转化， 使得这一转化技术开始成为植物基因工 程中新的生长点。由于目前多种植物的叶绿体基因组全序列已被测定，这就为外源基因通过同源重组机制定点整 合进叶绿体基因组奠定了基础，目前构建的叶绿体表达载体基本上都属于定点整合载体。构建叶 绿体表达载体基本上都属于定点事例载体。构建叶绿体表达载体时，一般都在外源基因表达盒的 两侧各连接一段叶绿体的DNA序列，称为同源重组片段或定位片段(Target ing fragme nt )。当 载体被导入叶绿体后，通过这两个片段与叶绿体基因组上的相同片段发生同源重组，就可能将外 源基因整合到叶绿体基因组的特定位点。在以作物改良为目的的叶绿体转化中，要求同源重组发 生以后，外源基因的插入既不引起叶绿体基因原有序列丢失，又不致于破坏插入点处原有基因的 功能。为满足这一要求， 已有的工作都选用了相邻的两个基因作为同源重组片段， 例如 rbcL/accD， 16StrnV/rpsl2rps7,psbA/trnK,rps7/ndhB 。当同源重组发生以后，外源基因定点插入在两个相邻 基因的间隔区，保证了原有基因的功能不受影响。最近， Daniel 等利用烟草叶绿体基因 trnA 和 trnI作为同源重组片段，构建了一种通用载体(universal vector)。由于trnA和trnI的DNA序列在高等植物中是高度保守的，作者认为这种载体可用于多种不同植物的叶绿体转化。如果这 种载体的通用性得到证实，那么这项工作无疑为构建方便而实用的新型叶绿体表达载体提供了一 个好的思路。由于叶绿体基因组的高拷贝性，定点整合进叶绿体基因组的外源基因往往会得到高效率表达， 例如 McBride 等人首次将 Bt CryIA（c） 毒素基因转入烟草叶绿体， Bt 毒素蛋白的表达量高达叶子 总蛋白的3%-5%而通常的核转化技术只能达到 0.001%0.6%。最近，Kota等将Bt Cry2Aa2蛋 白基因转入烟草转入烟草叶绿体，也发现毒蛋白在烟草叶子中的表达量很高，占可溶性蛋白的2%3%，比细胞核转化高出 2030 倍，转基因烟草不仅能抗敏感昆虫，而且能够百分之百地杀死那些 产生了高抗性的昆虫。 Staub 等最近报道， 将人的生长激素基因转入烟草叶绿体， 其表达量竟高达 叶片总蛋白的 7%，比细胞核转化高出 300倍。这些实验充分说明， 叶绿体表达载体的构建和转化， 是实现外源基因高效表达的重要途径之一。5 定位信号的应用上述几种载体优化策略主要目的是提高外源基因的转录和翻译效率，然而，高水平表达的外源 蛋白能否在植物细胞内稳定存在以及积累量的多少是植物遗传转化中需要考虑的另一重要问题。近几年的研究发现，如果某些外源基因连接上适当的定位信号序列，使外源蛋白产生后定向运 输到细胞内的特定部位，例如：叶绿体、内质网、液泡等，则可明显提高外源蛋白的稳定性和累 积量。这是因为内质网等特定区域为某些外源蛋白提供了一个相对稳定的内环境，有效防止了外 源蛋白的降解。例如，Wong等将拟南芥rbcS亚基的转运肽序列连接于杀虫蛋白基因之前，发现杀虫蛋白能够特异性地积累在转基因烟草的叶绿体内， 外源蛋白总的积累量比对照提高了 1020倍。 最近，叶梁、宋艳茹等也将rbcS亚基的转运肽序列连接于PHB合成相关基因之前，试图使基因表 达产物在转基因油菜种子的质体中积累，从而提高外源蛋白含量。另外，Wandelt等和Schouten等将内质网定位序列（四肽 KDEL勺编码序列）与外源蛋白基因相连接，发现外源蛋白在转基因植 物中的含量有了显著提高。显然，定位信号对于促进蛋白质积累有积极作用，但同一种定位信号 是否适用于所有的蛋白还有待于进一步确定。6 内含子在增强基因表达方面的应用内含子增强基因表达的作用最初是由 Callis 等在转基因玉米中发现的，玉米乙醇脱氢酶基因（Adhl）的第一个内含子（intron 1）对外源基因表达有明显增强作用，该基因的其他内含子（例 如 intron8,intron9 ）也有一定的增强作用。后来， Vasil 等也发现玉米的果糖合成酶基因的第一 个内含子能使CAT表达水平提高10倍。水稻肌动蛋白基因的第三个内含子也能使报道基因的表达 水平提高 26倍。至今对内含子增强基因表达的机制不不清楚，但一般认为可能是内含子的存在 增强了 mRNA勺加工效率和mRNA稳定性。Tanaka等人的多项研究表明，内含子对基因表达的增强 作用主要发生在单子叶植物，在双子叶植物中不明显。由于内含子对基因表达有增强作用， Mcelroy 等在构建单子叶植物表达载体时， 特意将水稻的肌 动蛋白基因的第一个内含子保留在该基因启动子的下游。 同样， Christensen 等在构建载体时将玉 米 Ubiquitin 基因的第一个内含子置于启动子下游，以增强外源基因在单子叶植物中的表达。然 而，有研究指出，特定内含子对基因表达的促进作用取决于启动子强度、细胞类型、目的基因序 列等多种因素，甚至有时会取决于内含子在载体上的位置。例如，玉米 Adhl 基因的内含子 9置于 Gus基因的5端，在CaMV35启动子调控下，Gus基因的表达未见增强；当把内含子置于 Gus基 因3端，在同样的启动子控制下，Gus基因的表达水平却增加了大约 3倍。由此可见，内含子对基 因表达的作用机制可能是很复杂的，如何利用内含子构建高效植物表达载体，目前还缺乏一个固 定的模式，值得进一步探讨。7 多基因策略迄今为止，多数的遗传转化研究都是将单一的外源基因转入受体植物。但有时由于单基因表达 强度不够或作用机制单一，尚不能获得理想的转基因植物。如果把两个或两个以上的能起协同作 用的基因同时转入植物，将会获得比单基因转化更为理想的结果。这一策略在培育抗病、抗虫等 抗逆性转基因植物方面已得到应用。例如，根据抗虫基因的抗虫谱及作用机制的不同，可选择两 个功能互补的基因进行载体构建，并通过一定方式将两个抗虫基因同时转入一个植物中去。王伟等将外源凝集素基因和蛋白酶抑制剂基因同时转入棉花，得到了含双价抗虫基因的转化植株。Barton 等将 Bt 杀虫蛋白基因和蝎毒素基因同时转入烟草， 其抗虫性和防止害虫产生抗性的能力大 为提高（专利）。在抗病方面，本实验室蓝海燕等构建了包含B -1 , 3-葡聚糖酶基因及几丁质酶基因的双价植物表达载体，并将其导入油菜和棉花，结果表明，转基因植株均产生了明显的抗病 性。最近，冯道荣、李宝健等将23个抗真菌病基因和hpt基因连在一个载体上，两个抗虫基因 与bar基因连在另一个载体上，用基因枪将它们共同导入水稻植株中，结果表明，70%勺R。代植株含有导入的全部外源基因（ 67个），且导入的多个外源基因趋向于整合在基因组的一个或两 个位点。一般常规的转化，尚不能将大于 25kb的外源DNA片段导入植物细胞。而一些功能相关的基因， 比如植物中勺数量性状基因、抗病基因等，大多成 基因簇勺形式存在。如果将某些大于 100kb 的大片段DNA如植物染色体中自然存在的基因簇或并不相连锁的一系列外源基因导入植物基因组 的同一位点，那么将有可能出现由多基因控制的优良性状或产生广谱的抗虫性、抗病性等，还可 以赋予受体细胞一种全新的代谢途径，产生新的生物分子。不仅如此，大片段基因群或基因簇的 同步插入还可以在一定程度上克服转基因带来的位置效应，减少基因沉默等不良现象的发生。最 近，美国的Hamilton和中国的刘耀光分别开发出了新一代载体系统，即具有克隆大片段DNA和借助于农杆菌介导直接将其转化植物的 BIBAC和TAC这两种载体不仅可以加速基因的图位克隆，而且对于实现多基因控制的品种改良也会有潜在的应用价值。目前，关于BIBAC和TAC载体在多基因转化方面的应用研究还刚刚开始。8 筛选标记基因的利用和删除筛选标记基因是指在遗传转化中能够使转化细胞（或个体）从众多的非转化细胞中筛选出来的 标记基因。它们通常可以使转基因细胞产生对某种选择剂具有抗性的产物，从而使转基因细胞在 添加这种选择的培养基上正常生长， 而非转基因细胞由于缺乏抗性则表现出对此选择剂的敏感性， 不能生长、发育和分化。在构建载体时，筛选标记基因连接在目的基因一旁，两者各有自己的基 因调控序列（如启动子、终止子等）。目前常用的筛选标记基因主要有两大类：抗生素抗性酶基 因和除草剂抗性酶基因。前者可产生对某种抗生素的抗性，后者可产生对除草剂的抗性。使用最 多的抗生素抗性酶基因包括 NPTII基因（产生新霉素磷酸转移酶，抗卡那霉素）、HPTS因（产生潮霉素磷酸转移酶，抗潮霉素）和 Ge nt基因（抗庆大霉素）等。常用的抗除草剂基因包括EPSP基因（产生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘磷）、GO）基因（产生草甘膦氧化酶、降 解草甘膦）、bar基因（产生PPT乙酰转移酶，抗Bialaphos或glufosinate ）等。上面这些当中 1、 2、 3、 5、 6都是值得注意的，特别是 5，因为你要向细胞外分泌。骨架载体可以 选择PB 1121，然后你可以在上面改动基因型。后面的就是克隆的步骤了，相对简单。1 首先获得目的基因加酶切位点，连入改好的载体中。2将质粒转入大肠杆菌DH5a扩增3 将扩增好的质粒转入植物细胞内进行表达4 收集根细胞外培养基检测是否有该蛋白的表达和分泌。至于改造载体那几个步骤要是答题的话简单说说就可以了，毕竟如果真的做出一个好载体都可以 自己开公司了。简单给你说一下步骤： 1 选择合适酶切位点，主要参考你所用的载体的多克隆位点，一般建议用双酶切，这样 就不存在方向验证的问题； 2 根据你所选用的酶切位点设计引物克隆基因； 3 分别酶切载体和基因的 PCR 产 物，然后回收。 可以选择切胶回收， 也可以用无水乙醇沉淀； 4 连接酶链接 5 转化 6 提质粒验证。 要进行 PCR 验证和酶切验证。 7 测序