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细细胞胞工工程程应用的原理和方法应用的原理和方法研究的水平研究的水平研究的目的研究的目的细胞生物学和细胞生物学和分子生物学分子生物学细胞水平或细细胞水平或细胞器水平胞器水平按照人们的意愿来按照人们的意愿来改变细胞内的遗传改变细胞内的遗传物质或获得细胞产物质或获得细胞产品品概念概念分类分类植物细胞工程植物细胞工程动物细胞工程动物细胞工程理论基础理论基础细胞的细胞的全能性全能性主主要要技技术术植物组织培养植物组织培养植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体技术单克隆抗体技术胚胎移植胚胎移植核移植核移植植物植物细胞细胞工程工程技术技术动物动物细胞细胞工程工程技术技术所采用技术的理论基础 植物细胞工程通常采用的技 术 手 段 植物组织培养植物组织培养 植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物细胞的全能性植物细胞的全能性（一）（一） 细胞的全能性细胞的全能性1、定义、定义： 具有某种生物全部遗传信息的任何一个细具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞都具有发育成完整生物体的潜能。胞都具有发育成完整生物体的潜能。 2、原理：、原理： 生物体的细胞一般地包含有该物种所特有生物体的细胞一般地包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个的每一个活细胞活细胞都应该具有全能性。都应该具有全能性。 3、差异：、差异： （1 1） 受精卵的全能性受精卵的全能性最高最高 （2 2） 受精卵分化后的细胞中，体细胞受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的的全能性比生殖细胞的低。低。 植物细胞的全能性植物细胞的全能性受精卵受精卵生殖细胞生殖细胞体细胞体细胞4、大小、大小5.细胞表现出全能性的条件细胞表现出全能性的条件 离体状态离体状态 有一定营养物质、激素和其他外界条件有一定营养物质、激素和其他外界条件 思考讨论：为什么体内细胞没有表现出思考讨论：为什么体内细胞没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织、器官？全能性，而是分化成为不同的组织、器官？ 基因在特定空间和时间条件下基因在特定空间和时间条件下选择性表达选择性表达的结果。在个体发育的不同时期，生物体不同的结果。在个体发育的不同时期，生物体不同部位的细胞表达的基因是不同的，合成的蛋白部位的细胞表达的基因是不同的，合成的蛋白质也不一样，从而形成了不同的组织和器官。质也不一样，从而形成了不同的组织和器官。植物组织培养关键词：关键词：外植体、脱分化、再分化、愈伤组织外植体、脱分化、再分化、愈伤组织细胞离体、一定的营养物质、细胞离体、一定的营养物质、激素和其他外界条件激素和其他外界条件必要条件：必要条件：植物组织培养 外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分组织或器官外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分组织或器官 1 1）外植体灭菌消毒（根尖、茎、芽、嫩叶、种子、花粉等）外植体灭菌消毒（根尖、茎、芽、嫩叶、种子、花粉等） 2 2）用消毒过的器械将外植体置于培养皿上）用消毒过的器械将外植体置于培养皿上 3 3）切取所需的外植体）切取所需的外植体 4 4）将外植体接种于培养容器的培养基上）将外植体接种于培养容器的培养基上 整个试验在超净工作台上进行，保持无菌！整个试验在超净工作台上进行，保持无菌！ 外植体经过一段时间在培养基上生长后，会形成愈伤组织外植体经过一段时间在培养基上生长后，会形成愈伤组织植物组织培养的培养基植物组织培养的培养基 定义：含有一定营养成分，供组织培养植物生长的定义：含有一定营养成分，供组织培养植物生长的基质基质 无机营养成分：无机营养成分：C C，H H，O O大量元素及部分微量元素大量元素及部分微量元素 有机营养成分有机营养成分 含含N N物质：包括维生素和氨基酸物质：包括维生素和氨基酸 碳源：碳源：2%2%5%5%的蔗糖的蔗糖 琼脂：起支持作用琼脂：起支持作用 激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素 PHPH值：值：5.05.06.06.0过程过程离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织愈伤组织根、芽根、芽植物体植物体外植体外植体脱分化脱分化植物激素：植物激素：细胞分裂素、生长素细胞分裂素、生长素再分化再分化植物组织培养植物组织培养条件植物组织培养条件： 含有全部营养成分的含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的气、无菌环境、适合的PHPH、适时光照等。适时光照等。（三）（三） 植物体细胞杂交植物体细胞杂交1 1、定义：、定义： 用两个来自不同植物的体细胞融合成用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。新的植物体的方法。 2 2、优势：、优势：（与有性杂交与有性杂交方法比较）方法比较） 打破了不同种生物间的生殖隔离限制，打破了不同种生物间的生殖隔离限制，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。围。植物体细胞杂交植物体细胞杂交去壁去壁去壁去壁纤维素酶纤维素酶果胶酶果胶酶原原生生质质体体植物细胞植物细胞原生质体融合原生质体融合离心、离心、振动、振动、电刺激、电刺激、聚乙二聚乙二醇醇再生细胞壁再生细胞壁杂种细胞杂种细胞去去分分化化愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株激素激素筛选筛选等量等量激素激素再分再分化化植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物植物A A细胞细胞植物植物B B细胞细胞去壁去壁原生质体原生质体A A原生质体原生质体B B原生质体融合原生质体融合融合体融合体再生壁再生壁杂种细胞杂种细胞细胞分裂细胞分裂愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株去壁的常用方法：去壁的常用方法：酶解法（纤维素酶、果胶酶等）酶解法（纤维素酶、果胶酶等） 原生质体融合方法原生质体融合方法：物理法：离心、振动、电刺激等物理法：离心、振动、电刺激等 化学法：聚乙二醇（化学法：聚乙二醇（PEGPEG） 植物体细胞杂交植物体细胞杂交制备原生质体制备原生质体：酶解法去掉细胞壁 诱导融会 新的原生质体新的原生质体 生出细胞壁 杂种细胞杂种细胞 组织培养 杂种植株杂种植株意义：克服远缘杂交不亲和的障碍、培育新品种意义：克服远缘杂交不亲和的障碍、培育新品种几个概念：几个概念： 愈伤组织：离体的植物器官、组织或细胞，在培养一段时间以后，通过细胞分裂，形成一种高度液泡化、无定形状态薄壁细胞组成的排列疏松无规则的组织。植物细胞的脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，又称去分化。植物细胞的再分化：脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化根或芽等器官的过程。1.微型繁殖微型繁殖 (1)微型繁殖技术:快速繁殖优良品种的植物组织培养技术. (2)特点: 保持优良品种的遗传特性; 高效快速地实现种苗的大量繁殖.2.作物脱毒作物脱毒 (1)材料:无病毒的茎尖 (2)脱毒苗:切取茎尖进行组织培养获得3.神奇的人工种子 (1)特点: 后代无形状分离 不受气候,季节和地域限制 (2)技术:植物组织培养. (3)结构:人工薄膜胚状体或不定芽或顶芽或腋芽.1.单倍体育种(1)方法:花药的离体培养(2)优点:后代稳定遗传,都是纯合体;明显缩短育种年限.2.突变体的利用 (1)产生:植物组织培养 (2)利用:筛选对人们有利突变体,进而培育新品种1.种类:蛋白质,脂肪,糖类,药物,香料,生物碱等.2.技术:植物的组织培养.动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体技术单克隆抗体技术核移植核移植动物动物细胞细胞工程工程常用常用技术技术动物细胞工程动物细胞工程2 2、动物细胞培养的应用和概念：、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织取出相关的组织, ,将它分散成单个细胞将它分散成单个细胞, ,然后然后, ,放在适宜的培养基中放在适宜的培养基中, ,让这些细胞让这些细胞生长和增殖生长和增殖. .一、动物细胞培养一、动物细胞培养1.发展历史发展历史:3、动物细胞的培养过程、动物细胞的培养过程 幼龄动物幼龄动物取动物器官取动物器官和组织和组织剪碎组织剪碎组织胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理细胞培细胞培养养单个细胞单个细胞动物细胞培养技术动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础是其他动物细胞工程技术的基础3、动物细胞培养过程：、动物细胞培养过程：动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶10代细胞代细胞原代培养原代培养50代细胞代细胞传代培养传代培养细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系单个细胞单个细胞加培养液加培养液遗传物质遗传物质未改变未改变遗传物质遗传物质已改变已改变动物组织细胞间隙中动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织定弹性和韧性的组织和器官。和器官。（分解弹性纤维）（分解弹性纤维） 思考讨论：在动物细胞培养过程中，思考讨论：在动物细胞培养过程中，为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织进行处理？织进行处理？ 胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。他成分酶解，获得单个细胞。 有关概念有关概念: 原代培养：原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。初从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。初次培养称为原代细胞培养。次培养称为原代细胞培养。 传代培养：传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养代培养。有关概念有关概念细胞株：细胞株：原代细胞一般传至原代细胞一般传至1010代左右细胞代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到活到40504050代，这种传代细胞为细胞株。代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞系：细胞株传代至细胞株传代至5050代后又出现细胞代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。种传代细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。容易传代培养。3.3.动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件: :1.1.无菌无毒的环境无菌无毒的环境2.2.营养营养3.3.温度和温度和pHpH4.4.气体环境气体环境 4.4.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用: : 1.1.蛋白质生物制品的生产蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体 2.2.健康细胞培养健康细胞培养 培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植 3.3.细胞的生理、药理、病理研究细胞的生理、药理、病理研究 植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖培养基性质培养基性质固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基培养基特有成培养基特有成分分蔗糖蔗糖 植物激植物激素素葡萄糖葡萄糖 动物血动物血清清培养结果培养结果植物体植物体细胞株、细胞细胞株、细胞系系培养目的培养目的快速繁殖、培快速繁殖、培育无病毒植株育无病毒植株获得细胞或细获得细胞或细胞分泌蛋白胞分泌蛋白2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？物细胞培养材料？1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？基有何独特之处？3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？成新个体？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：等。独特之处有：1、液体培养基、液体培养基 2、成分中有动物血清、成分中有动物血清因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体成新的动物个体二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发使其重组并发育成一个新的胚胎育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物这个新的胚胎最终发育为动物个体个体.核移植技术核移植技术1.克隆羊培育过程克隆羊培育过程黑面绵羊去黑面绵羊去核卵细胞核卵细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核细胞核移植细胞核移植重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期胚胎早期胚胎胚胎移植胚胎移植另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利胚胎移植技术胚胎移植技术胚胎移植的基本程序如下（以牛胚胎移植为例）2.体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景3.体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题一、动物细胞融合一、动物细胞融合 细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用动物动物细胞细胞融合融合细胞融合与融合诱导细胞融合物质：细胞融合与融合诱导细胞融合物质： 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。 细胞融合技术应用于哪些方面？细胞融合技术应用于哪些方面？ 细胞学、遗传学、免疫学及制备单克隆抗体。细胞学、遗传学、免疫学及制备单克隆抗体。二、单克隆抗体二、单克隆抗体什么是抗体？什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。能的球蛋白。浆细胞产生抗体。浆细胞产生抗体。B B淋巴细胞与抗体的关系：淋巴细胞与抗体的关系：B B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。体。动物体内的动物体内的B B淋巴细胞可以产生百万种淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。特异性免疫作用。每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。所以传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？所以传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？怎样解决这个问题？怎样解决这个问题？单克隆抗体单克隆抗体 由单个由单个B B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。克隆抗体。 特点：特点：特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高 如何大量生产单克隆抗体？如何大量生产单克隆抗体？ 利用淋巴细胞产生抗体的功能利用淋巴细胞产生抗体的功能 利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用肿瘤细胞无限增殖的特性 利用细胞融合的技术将利用细胞融合的技术将两种细胞融合两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞杂交瘤细胞 利用动物细胞培养技术大量培养杂交利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞瘤细胞如何筛选？如何筛选？融融合合方方式？式？ 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体思考：思考：1 1、本过程利用了哪些原理？、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理原理2 2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B B细胞融细胞融合？合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有胞的遗传物质，不仅具有B B细胞分泌抗体细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体可以获得大量单克隆抗体单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。强，灵敏度高，优越性十分明显。应用主要有：应用主要有：1 1、临床诊断、临床诊断2 2、作为载体，运载抗癌药物，形成、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹生物导弹”治疗肿治疗肿瘤瘤资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶病灶”也引起人也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。断。植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合原理细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、 细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞融合的方法细胞融合的方法 去除细胞壁后诱导去除细胞壁后诱导原生质体融合原生质体融合使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合诱导方法诱导方法物理（离心、振荡、物理（离心、振荡、电刺激）电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒用途用途获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗体制备单克隆抗体 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案杆菌的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中、图中B为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继作为诱导剂，该细胞继承承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,又能又能_。1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_3、A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,该细胞能够产生该细胞能够产生_5、C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_培养和培养和_培养两个阶段，其培养两个阶段，其中中_代以内的的细胞属于细胞株。代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体制备单克隆抗体B细胞细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代50B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC
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