1.4蛋白质工程的崛起.ppt.

LifeScience1.4LifeScience蛋白质工程崛起一、蛋白质工程崛起的缘由通过基因工程原则上只能生产自然界已经存在 的蛋白质能够大规模生产生物体内微量存在的活性 物质，并借助转基因而改变动植物性状，得以在人 类医疗保健中进行基因诊断和基因治疗。然而在广 泛利用自然界各种蛋白质的过程中就发现，这些蛋 白质只是适应生物自身的需要，而对它们进行产业 化开发往往不合意，需要加以改造。1983年Ulmer 首先提出蛋白质工程，它是指按照特定的需要，对 蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此以后，蛋 白质工程迅速发展，已成为生物工程的重要组成部分。在已研究过的几千种酶中,只有极少数可以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业 生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工 业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生 产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机 溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大多 数酶会很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工 业生产中一个非常重要的课题。一般来说，提高 蛋白质的稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶 的热稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于 重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。例如:干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将 人的干扰素的CDNA在大肠杆菌中进行表达，产生 的干扰素的抗病毒活性为106 U/mg,只相当于天 然产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的卩 干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式 存在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究 发现，卩干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17位. 31位和141位），推测可能是有一个或几个半胱氨 酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位的 半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结 果使大肠杆菌中生产的卩干扰素的抗病性活性提 高到108 U/mg,并且比天然卩-干扰素的贮存稳定 性咼很多。LifeScience再如玉米中的赖氨酸含量比较低，原因是合成赖氨酸 的两个关键酶一一天冬氨酸激酶和二氢毗唳二竣酸合 成酶的活性，受细胞内的赖氨酸浓度的影响较大，当赖 氨酸的浓度达到一定量时，就会抑制这两种酶的活性. 如果将该酶的第352位的天冬酰胺变成异亮氨酸，将二 氢毗唳二竣酸合成酶的苏氨酸变成异亮氨酸,就可以 使玉米叶片和种子中游离的赖氨酸提高5倍和2倍“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对 基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究，包括研究 蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。Science二、蛋白质工程的基本原理分子SrttLifeScience蛋白质工程的主要步骤通常包括：(1) 从生物体中分离纯化目的蛋白；(2) 测定其氨基酸序列；(3) 借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解 白质的二维重组和三维晶体结构；(4) 设计各种处理条件，了解蛋 白质的结构变化，包括折叠与去折 叠等对其活性与功能的影响；(5) 设计编码该蛋白的基因改造 方案，如点突变；(6) 分离、纯化新蛋白，功能检 测后投入实际使用。IQS(-)蛋白质的分子设计与改造蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础,通过蛋白质的一级结构、晶体结构和溶液构象的 研究，积累了成千上万蛋白质一级结构和高级结 构的数据资料，并编制成系统的数据库，得以从中找出蛋白质分子间的进化关系、一级结构和高 级结构的关系、结构与功能的关系方面的规律。蛋白质作为生物大分子是生物化学和分子生物学的 研究重点，大量蛋白质被分离纯化，测定了它们的结构、 性质和生物学作用。分子生物学有关基因组的研究，也 可以用以推测出一些未知蛋白质的结构与功能。采用定 位诱变的方法，可以对编码蛋白质的基因进行核昔酸密 码子的插入、删除、置换和改组，其结果为分子改造提 供新的设计方案。现有的蛋白质是生物长期进化的结果， 蛋白质工程则是对生物进化的模拟，按照蛋白质形成的 规律，改造蛋白质或构建新的蛋白质。蛋白质的改造通常需要先经周密的分子设计，然后依 赖基因工程获得突变型蛋白质，以检验其是否达到了预 期的效果。如果改造的结果不理想，还需要从新设计再 进行改造，往往经历多次实践摸索才能达到改进蛋白质 性能的预定目标。（二）蛋白质改造工程举例1.水蛭素改造水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂， 它有多种变异体，由65或66个氨基酸残基组成。水 蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。 为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基 础上提出改造水蛭素主要变异体HV2的设计方案， 将47位的Asn （天冬酰胺）变成Lys （赖氨酸）， 使其与分子内第4或第5位Th（苏氨酸）间形成氢 键来帮助水蛭素N端肽段的正确取向，从而提高凝 血效率，试管试验活性提高4倍，在动物模型上检 验抗血栓形成的效果，提高20倍。LifeScienceUfeScience2.生长激素改造生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体的生 长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还可以结合 许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发其他生理过程。 在治疗过程中为减少副作用，需使人的重组生长激素只与 生长激素受体结合，尽可能减少与其他激素受体的结合。 经研究发现，二者受体结合区有一部分重叠，但并不完全 相同，有可能通过改造加以区别。由于人的生长激素和催 乳激素受体结合需要锌离子参与作用，而它与生长激素受 体结合则无需锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基 的氨基酸侧链，如第18和第21位His （组氨酸）和第17位 Glu （谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开发作 为临床用药还有大量的工作要做。3.胰岛素改造天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚 体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓 了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素 B23-B28氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程 技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰 岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。二IJfeScienceIJfeScience4.治癌酶的改造癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞， 特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化学 药物的侵害，可以提高化学治疗的剂量。疱疹病毒（HSV） 胸腺嚅唳激酶（TK）可以催化胸腺嚅唳和其它结构类似物 磷酸化而使这些碱基宙-OH缺乏，从而阻断DNA的合成，杀 死癌细胞。HSVTK催化能力可以通过基因突变来提高。 从大量的随机突变中进行筛选出一种酶，在酶活性部位附近 有6个氨基酸被替换，催化能力20倍以上。蛋白质工程的发展很快，研究工作很多，以上仅介绍了 几个例子。蛋白质工程除了用于改造天然蛋白质或设计制 造新的蛋白质外，其本身还是研究蛋白质结构功能的一种 强有力的工具，它在解决生物理论方面所起的作用，可以 和任何重大的生物研究方法相提并论。何谓蛋白质工程?在现代生物技术中，蛋白质工程出现得最晚， 是在20世纪80年代初期出现的。1983年“蛋白 质工程”这个名词出现后，随即被广泛接受和 采用。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规 律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修 饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一 种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。二三、蛋白质工程的进展和前景蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的 一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质 结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研 究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭 新的时代，为蛋白质和酶在工业.农业和医药 方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开 创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的 蛋白质的新时期。二