冰冻切片免疫荧光染色流程

冰冻切片免疫荧光染色流程 (表面分子，以 CD4 为例 )(1) 冰冻切片室温晾干 15 分钟；(2) 用组化油笔将待染组织圈好，置 PBS中浸泡10分钟，以去除OCT(3) 用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时(此步可以不洗涤， 把封闭液吸干即可)；(4) 加入 CD4 单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA, 4C孵育过夜；(5) PBS洗3次，每次10分钟；(6) 加入罗丹明标记的 羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37C孵育1 小时；(7) PBS洗3次，每次15分钟；( 8) 封片后，荧光显微镜观察结果并拍照；(9) 在每切片中随机选择 5个视野计数阳性细胞数。注意事项：( 1 )整个实验过程中勿使表面干燥 (2)稀释、加二抗(荧光抗体)及此后的洗涤过程中注意避光附注 1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100附注 2：所用液体(表面分子染色不用 0.3%TrixtonX100 )：( 1) pH7.4 0.01MPBS：配 方为：0.1MPBS 1OOml+ddH2O 900ml+NaCI 7.65g0. 1MPBS配 方 为：Na2HPO4 23g+NaH2PO42H2O( 2)洗涤液：5.9g+NaCI17g定容至 2000ml,高压，pH7.2-7.40.3%TrixtonX100 pH7.4 0.01MPBS，分装 15ml/ 支20 C 保存( 3)封闭液：10% NG 0.3% TrixtonX100 pH7.4 0.01MPBS，分装 1.2ml/支20C保存(4)抗体稀释液：1% BSA- 0.3% TrixtonX100 pH7.4 0.01MPBS，分装 1ml/支20C保存