第一章 透射电镜的用途

第一章 透射电镜的用途 17世纪光学显微镜的发明，促进了细胞学的发展，20世纪电子显微镜的发明，揭开了病毒和细胞亚显微结构的奥妙。在20世纪60年代以来，TEM广泛应用于工农业生产、材料学、考古学、生物学、组织学、病毒学、病理学和分子生物学等研究领域中，其应用的广度、研究的深度有如下几方面。一、 细胞学由于超薄切片技术的出现和发展，人类利用电镜对细胞进行了更深入的研究，观察到了过去无法看清楚的细胞超微结构。例如，用电镜观察到了生物膜的三层结构以及细胞内的各种细胞器的形态学结构等。二、发现和识别病毒许多病毒，尤其是肿瘤病毒就是用TEM发现的。电镜也为病毒的分类提供了最直观的依据，例如去年肆虐全球的SARS病毒就是首先在电镜下观察到并确认是病毒而不是支原体的。三、临床病理诊断生物体发生疾病都会导致细胞发生形态和功能上的改变，通过对病变区细胞的电镜观察就可以为疾病诊断提供有力依据。例如目前电镜在肾活检、肿瘤诊治中发挥了重要作用。四、免疫学电镜技术与生命科学中新兴起的技术相结合，促进了新技术的应用。例如电镜技术与免疫学技术相结合产生了免疫电镜技术，它可以对细胞表面及细胞内部的抗原进行定位，可以了解抗体合成过程中免疫球蛋白的分布情况等。五、细胞化学研究细胞内各种成分在超微结构水平上的分布情况以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化，以阐明细胞的化学和生化功能。其中最主要的是蛋白质（尤其是酶的细胞内定位），其次是核酸、脂肪、碳水化合物及无机离子的定位。该技术促进了形态学和生物化学的结合，使生命科学的研究进入了新的水平。第二节 在材料科学中的应用材料科学研究的对象是制造设备和产品的金属、半导体、塑料等，以及工艺技术，例如研究如何制造出更小、品质更好的晶体管，以使计算机的功能更为强大；研究聚合物的电子特性以生产更便宜的手机显示屏；或者分析如何使肌体组织与医用植入物更好地结合。一、用DNA适体构建蛋白纳米结构。二、纳米金属中空位与扩散。三、载药纳囊技术的应用。第二章 透射电镜（TEM）的原理和结构透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像。通常，透射电镜的分辨率为0.10.2nm，放大倍数为几万几十万倍，用于观察超微结构，即小于0.2m，在光学显微镜下无法看清的结构，又称“亚显微结构”。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备超薄切片(通常为50100nm)。其制备过程与石蜡切片相似，但要求极严格。要在机体死亡后的数分钟内取材，组织块要小(1mm3以内)，常用戊二醛和锇酸双重固定，包埋介质包埋,用超薄切片机(ultramicrotome)切成薄片，再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色。成像方式与光学生物显微镜相似，只是以电子透镜代替玻璃透镜。第一节 TEM的工作原理和主要结构一、透射电镜的工作原理 由钨丝阴极在加热状态下发射电子。经过电场加速形成一个直径50m大小的电子源（相当于光学显微镜的光源）。经过双聚焦镜，发射的电子束被聚焦在样品上（电子束斑直径为3-5m）。穿过样品的电子束经过物镜，在其像平面上形成第一幅高质量的样品形貌放大像，然后再经过中间镜和投影镜的两次放大，最终形成三级放大像而显示在荧光屏上，或当荧光屏竖起来时就被记录在照相底片上。 二、TEM的结构照明系统电子枪聚光镜成像系统和样品装置系统样品室物镜中间镜投影镜像的观察和记录系统观察室摄影室镜筒 TEM的结构由镜筒（电子光学系统）、真空系统、电子学系统三个主要部分组成。（一）镜筒：按功能可分为三个系统。1照明系统该系统分成两部分：电子枪和聚光镜。电子枪由灯丝(阴极)、栅级和阳极组成。加热灯丝发射电子束。在阳极加电压，电子加速。阳极与阴极间的电位差为总的加速电压。经加速而具有能量的电子从阳极板的孔中射出。射出的电子束能量与加速电压有关，栅极起控制电子束形状的作用。电子束有一定的发射角，经聚光镜调节后，形成很小的平行电子束。电子束的电流密度(束流)可通过聚光镜的电流来调节。（1）电子枪 电子枪：发射电子，由阴极、栅极、阳极组成。阴极管发射的电子通过栅极上的小孔形成射线束，经阳极电压加速后射向聚光镜，起到对电子束加速、加压的作用。是电镜的照明源，产生和加速电子，照明样品，要求电子枪有很高的亮度、电子发射稳定及稳定的加速电压。 电子枪是由发夹式钨丝阴极三级电子枪。它由阴极、栅极和阳极组成。阴极即灯丝，是用直径0.100.12mm的钨丝做成的，通常做成发夹形状，当电流加热至2200-2500K时，灯丝产生热电子发射作为电子源。阳极对阴极有一加速电压，对电子起加速作用。一般采用负高压，高压由高压发生器产生，通过高压电缆输送过灯丝。常用的加速电压为50KV、75KV和100KV，超高压电镜可达3000KV。加速电压决定电子束波长。 栅极（控制极）可以控制阴极发射电子束的形状和发射强度，对电子发射起限制和稳定的作用。 栅偏压对灯丝因加热电流的变化或加速电压的变化所引起的束流变化，有稳定的作用。而且栅偏压可以调节，通过改变栅偏压的方法可以改变图像的亮度（2）聚光镜聚光镜的作用是将电子枪所发出的电子束会聚到样品平面上。并调节电子束的孔径角、电子束的电流密度和照明光斑的大小。 现代电镜有2个聚光镜，第一聚光镜是一个短焦距的强磁透镜，可将电子枪交叉点缩小几十倍到一百倍，使束斑为零点几微米或几个微米。第二聚光镜是一个长焦距弱磁透镜，将第一聚光镜的像再次成像在样品平面上。 聚光镜装有固定光阑和活动光阑，可以得到不同的照明孔径角。2.成像系统和样品室系统该系统包括样品室、物镜、中间镜、反差光栏、衍射光栏、投射镜以及其它电子光学部件。（1）样品室放置待观察的样品，并装有倾转台，用以改变试样的角度，还有装配加热冷却等设备。 有一套机构，保证样品经常更换时不破坏主体的真空。样品可在X、Y二方向移动，以便找到所要观察的位置。经过会聚镜得到的平行电子束照射到样品上，穿过样品后就带有反映样品特征的信息，经物镜和反差光栏作用形成一次电子图像，再经中间镜和投射镜放大一次后，在荧光屏上得到最后的电子图像。（2）成像系统 物镜：为放大率很高的短距透镜，对样品成像和放大。它是决定TEM分辨本领和成像质量的关键。因为它将样品中的微细结构成像、放大，物镜中的任何缺陷都将被成像系统中的其它透镜进一步放大。中间镜：是一个可变倍率的弱透镜，可以对电子像进行二次放大。通过调节中间镜的电流可选择物体的像或电子衍射图来进行放大。 投影镜（透射镜）：为高倍的强透镜，最后一级放大镜，用来放大中间像后在荧光屏上成像。在二级放大（用物镜和投影镜）中放大倍数可变，以控制终像的总放大倍数。在三级以上放大中，放大倍数固定。消像散器：消像散器是一个附加可调的电场和磁场，以补偿透镜磁场的轴不对称性。 轴不对称、光阑和极靴的污染可引起图像模糊。（2）样品装置系统样品载体：载网直径3mm,厚50100m。一般采用带膜（福尔瓦膜）的载网。样品架：固定载网的装置。有顶落式（一次装12个载网）和侧插式（一次可装几个铜网）样品台：在移动装置控制下，可以带着样品架移动。样品室有气锁装置，换样品时控制最少量的空气进入镜筒，以便在最短的时间内恢复工作真空。（3）像的观察和记录系统位于投影镜的下部，包括观察室和摄影室。观察室内有一荧光屏，在电子束照射下，可呈现终像。电子图像反映在荧光屏上,荧光发光和电子束流成正比。在主观察窗外有一个观察放大镜，以对图像精确聚焦和观察，可以把终像放大3-10倍。观察放大镜是双目光学显微镜。摄影室在观察室的下方，把选择好的像记录在软片上，有专门的快门装置。软片的感光能力与其波长有关。（二）真空系统 1.真空系统的主要结构由机械泵、油扩散泵、真空测量仪器及真空管道组成。它的作用是排除镜筒内气体，使镜筒真空度至少要在10-5托以上，目前最好的真空度可以达到10-910-10托。如果真空度低的话，电子与气体分子之间的碰撞引起散射而影响衬度，还会使电子栅极与阳极间高压电离导致极间放电，残余的气体还会腐蚀灯丝，污染样品。2.电镜要求电子通道是真空的，其原因为：（1）气体分子与高速电子相互作用而随机散射电子，会引起炫光，或减少像的反差。一般要求真空达到10-5托。（2）电子枪中存在的残余气体会产生电离和放电， 从而引起电子束不稳定或闪烁（3）残余气体与灼热灯丝作用，会不断腐蚀灯丝，缩短灯丝使用寿命。（4）残余气体聚集到样品上而污染样品。 （三）电子学系统透射电镜的电路主要由以下部分组成，高压直流电源、透镜激磁电源、偏转器线圈电源、电子枪灯丝加热电源，以及真空系统控制电路、真空泵电源、照相驱动装置及自动曝光电路等。控制和调节电镜的工作状态。高压电源：供给电子加速的加速电压，常用的加速电压为50kV、75kV、100kV、最高可达3000kV。透镜电源：提供电子束聚集和各个磁透镜的激磁电流。电源要求很高的稳定性能。任何波动都将引起像的变化，从而降低分辨率。真空系统电源：提供各真空装置电源。加速电压和透镜磁电流不稳定将会产生严重的色差及降低电镜的分辨本领，所以加速电压和透镜电流的稳定度是衡量电镜性能好坏的一个重要标准。此外还有二级真空泵来对样品室抽真空、照相装置用以记录影像。电子波。电子光源和电子枪。静电透镜；短磁透镜和强磁透镜。电子透镜的像散；消像散器。第二节 透射电镜的成像原理透射电镜是利用透过样品的透射电子成像的。电子枪发射出电子射线，经透射系统照射在样品上，电子束与样品相互作用后，当电子射线在样品另一方重新出现时，已带有样品内的信息，然后进行放大处理而成像，在终屏上形成带有样品信息的图像，使人眼能够识别。电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子发射，如电子束投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电子照片上则呈黑色。称电子密度高(electron dense)。反之，则称为电子密度低(electron lucent)。一、透射电子显微镜的成像原理可分为三种情况： 1吸收像：当电子射到质量、密度大的样品时，主要的成相作用是散射作用。样品上质量厚度大的地方对电子的散射角大，通过的电子较少，像的亮度较暗。早期的透射电子显微镜都是基于这种原理。 2衍射像：电子束被样品衍射后，样品不同位置的衍射波振幅分布对应于样品中晶体各部分不同的衍射能力，当出现晶体缺陷时，缺陷部分的衍射能力与完整区域不同，从而使衍射钵的振幅分布不均匀，反映出晶体缺陷的分布。 3.相位像：当样品薄至100?以下时，电子可以传过样品，波的振幅变化可以忽略，成像来自于相位的变化。 二、透射电镜衬度（反差）的来源TEM衬度的形成,物镜后焦面是起重要作用的部位。电子经样品散射后，相对光轴以同一角度进入物镜的电子在物镜后焦面上聚焦在一个点上。散射角越大，聚焦点离轴越远,如果样品是一个晶体,在后焦面上出现的是一幅衍射图样。与短晶面间距（或者说高空间频率）对应的衍射束被聚焦在离轴远处。在后焦面上设有一个光阑。它截取那一部分电子不但对衬度，而且对分辨本领有直接的影响。如果光阑太小，把需要的高空间频率部分截去，那么和细微结构对应的高分辨信息就丢失了。样品上厚的部分或重元素多的部分对电子散射的几率大。透过这些部分的电子在后焦面上分布在轴外的多。用光阑截去部分散射电子会使质量厚度大的部位在像中显得暗。这种衬度可以人为地造成，如生物样品中用重元素染色，在材料表面的复形膜上从一个方向喷镀一层金属，造成阴阳面等。散射吸收(指被光阑挡住)衬度是最早被人们所认识和利用的衬度机制。就表面复型技术而言，它的分辨本领可达几十埃。至于晶体样品的衍衬像和高分辨的点阵像的衬度来源，见点阵像和电子衍衬像。 三、像的反差形成原理（电镜的反差主要有三种） （1）振幅反差 电子散射： 当一定能量入射到样品，由于受到样品中原子的核和核外电子的静电场的作用，使电子运动方向和速度发生变化。电子散射产生振幅反差，是TEM最重要的成像机制。 振幅反差是由样品的质量厚度不同引起的透射中的电子波强度（振幅）变化所提供。对于结构细节大小超过0.10.15m ，厚度大于10m的样品，其反差主要是由振幅反差提供。 （2）相位反差：对于微细结构0.15m 、厚度小于10m的成像，其反差主要是由相位反差提供。 （3）衍射反差：可以加强图像的反差，但像的分辨率将下降。四、 提高散射反差的方法1缩小孔径角：光栏孔越小，像的反差越大。2选择正确的欠焦量，而获得样品的最好反差。离焦反差：调节物镜使像稍欠焦或稍过焦，像的反差显著地增大。3适当降低加速电压，因为电子的散射角度的大小与加速电压的平方成反比关系，降低电子加速电压可以提高图像的反差。4利用暗场显微方法。用直接透过电子通过光阑所成的像为明场像，相反用散射电子所成的像为暗场像，两者的反差相反。第三章 透射电镜的操作一、TEM的操作步骤 1接通电镜工作电源后，电镜开始通过机械泵抽前级和镜筒真空。 2当镜筒真空达到一定要求时，再由扩散泵抽镜筒的高真空。 3当高真空能达到加高压的要求时，面板上高真空指示灯亮，表明此时可以加高压了，接通高压并调整高压到合适的高压值。4稍等一会待高压稳定后，再加灯丝电流，使荧光屏中心产生一个明亮的光斑。5随后依次接通各级透镜的工作电流，调整电镜的工作状态。 6调整好后再装入样品进行观察，可用低倍的双目镜对图像聚焦。要选择亮度均匀的区域作为拍摄对象，尽可能使图像充满拍摄区域，把主要的观察对象放在荧光屏中心，对感兴趣的部位拍照记录。 7电镜使用完毕，应依次关闭高压、灯丝加热电流、关闭各级透镜工作电流以及取出样品。 8待冷却水再工作1015min后，关闭电镜和冷却水。二、透射电镜的调试 主要调整对中、饱和点、灯丝像和消像散等。1对中（合轴）：为了获得高分辨率和高质量的像，要求电子枪和所有的透镜以及光栏等光学部件都在同一轴线上。 2消像散：理想的成像要求磁透镜的磁场轴是对称的，而实际上，因各种原因会引起磁场轴不对称，因而产生的像差。 3聚焦：一般电镜放大率的改变是通过改变中间镜激磁电流来实现中间镜的焦距改变，它的物平面在镜筒内上下移动，此时必须使物镜的像平面和中间镜的物平面重合，像才清晰，这个过程称为聚焦。三、 像的观察和记录 1观察（寻找视野）。尽可能在低倍下寻找视野，选择最佳的研究图像。 2调好电压对中、电流对中、亮度对中，消除像散，使物镜光阑孔与中心透射斑点同心。 3拍照。一般电镜拍照时可降低放大倍率，再根据研究需要用光学放大机放大。电镜样品由于受电子束照射后，有时会被损坏，所以好的视野要抓紧拍照。四、图象分析 1判断污染、刀痕、颤痕、皱折、染色剂沉淀等。 2综合分析图像，做出立体判断。 3照片一般要有标尺。 第四章 生物样品的制备第一节 概述透射电镜在材料科学、生物学上应用广泛。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到最后的成像质量，因此，必须制备超薄切片，切片厚度一般为50100nm。所以用透射电镜观察时的样品需要处理得很薄。常用的切片方法有：超薄切片法、冷冻超薄切片法、冷冻蚀刻法、冷冻断裂法等。对于液体样品，通常是将样品放置铜网上，经负染后进行观察。一、STM的特点1.分辨本领高，最高分辨率0.10.2nm，比光镜提高1000倍，已达到原子水平。2. 由于样品制备技术的限制，对大多数生物样品，一般只能达到2nm的分辨水平。3.电镜图像的分辨能力不仅取决于电镜本身的分辨率，而且也取决于样品结构的反差。4.透射电镜所用的光源是电子波，波长在非可见光范围内，所以无颜色反应，所形成的图像是黑白图像，要求图像有一定的反差。5.生物体组织和细胞成分主要由C、H、O、N等轻元素组成，它们的原子序数较低，对电子散射能力弱，相互之间的差别又很小，电镜下的图像反差一般偏低。 6.电子的穿透能力较弱，样品必须很薄。要求厚度为50100nm。7.观察面小，载网直径为3mm，超薄切片范围为0.05mm。8.电子束的强烈照射，易损伤样品，发生变形、升华等，甚至被击穿破裂。9.为保证样品在真空下不损伤，样品必须彻底干燥。10.生物制样复杂，步骤繁多，容易改变样品结构。二、电镜样品取材的基本要求1.快取材的动作要迅速，材料离体后必须尽快投入固定液，减少自溶作用的影响。解剖器械要锋利，动作要轻巧，避免牵拉和挤压，尽量减少取材中的机械损伤。2. 准取材要准确。器官要准确部位要准确：如脑垂体的前叶和后叶要分清，其结构和功能各不相同。3. 冷取材过程应尽量在低温下进行，所用的固定液及容器都应预冷，以降低酶的活性，减少细胞内结构的损失。4. 小所取材料体积要小，一般大小不超过1mm3，或截面为1mm2的长条，或厚度在0.1mm以下的薄片。因为固定剂的渗透力较弱，若组织块太大，块的内部将得不到良好的固定。三、切片的基本要求 1.厚度5080nm。 2.有良好的反差。 3.耐电子束轰击。 4.细胞结构保存良好，没有明显的物质凝集、丢失或添加等人工效应。 5.切片均匀，没有皱折、刀痕及染色剂沉淀等。第二节 TEM的制样技术 目前，TEM的应用，已将静止的形态学观察与动态的功能研究相结合，研究细胞内物质的合成，转移、生理、生化反应的过程，定位等。电镜技术的发展不仅表现在仪器本身性能的高度完善和种类的增多，而且还反映在与其相应的各种样品制备和应用技术。根据不同的样品，不同的研究目的，必须采用不同的制样方法。一、制样方法1常规超薄切片技术一般的透射电镜电子束的穿透能力较弱，大多数标本无法直接在电镜下观察，必须切成厚度为5070nm的超薄片，这种制作超薄片的技术称为超薄切片技术。在透射电镜的生物样品制备方法中，超薄切片技术是最基本最常用的制备技术，其他一些样品制备技术，如细胞化学技术，免疫电镜技术及电镜放射自显影技术都离不开超薄切片的制作。利用透射电镜观察超薄切片，可以了解细胞的精细结构。通常用于静态结构观察，用锇酸和戊二醛固定样品，环氧树脂包埋，再用热膨胀或螺旋推进的方式进行样品切片，切片后采用重金属盐染色，以增大反差。2.负染色技术负染色技术也叫阴性反差染色，它是由Hall等首先采用的一种染色技术，与超薄切片法相比，该技术具有分辨率高、简单易行和快速方便等优点。因此在生物学研究中广泛应用。这种方法可以显示大分子、细菌、病毒、原生动物、分离的细胞器及蛋白质晶体等样品的形状、大小和表面结构特征。尤其是在病毒学领域，有关病毒的分类及病毒亚单位结构的显示、病毒与抗体的相互作用等的研究中，负染色更是不可缺少的实验技术。负染就是将样品的背景染色以突显样品。一般用电子密度高，本身不会显示任何结构，又和样品不起反应的物质。如重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸出的地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右，常用于观察微小颗粒材料。 3 金属投影与复型技术 金属投影技术是利用真空喷镀仪对样品进行投影的一种技术，Williams首先用这种技术用于增加电镜图象的反差。该技术还可用来测量颗粒及大分子的大小。复型技术主要用于样品表面结构的研究。某些坚硬的材料，如牙齿、骨骼、金属等，它们是不透明的，并且很难制成超薄切片，对于这些材料可用一种电子透明的薄膜将其表面结构复制下来，即成复型。通过对该复型样品的观察，就可以了解原有样品的天然断面或人工断面的结构特征。 4 冷冻切片技术和冷冻蚀刻复型技术 冷冻切片技术是使样品迅速冷却，然后用冷冻切片机进行冷冻切片，它省去了普通超薄切片中繁杂的化学固定与包埋操作。该技术在细胞化学研究中有着特殊用途。冷冻蚀刻复型技术是一种冷冻断裂与复型相结合的样品制备技术，该技术在生物学中的广泛应用不仅验证了超薄切片所展示的细胞超微结构，而且还揭示了某些前所未见的新结构，尤其是在显示生物膜的结构方面，该技术有着独特作用。冰冻蚀刻（亦称冰冻断裂）。标本置于-100C的干冰或-196C的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，能暴露出材料的内部立体结构。蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的图像即代表标本中细胞断裂面处的结构。主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 5 电镜细胞化学技术 电镜细胞化学技术又称超微结构细胞化学技术，它是从光镜组织化学的基础上发展起来的一种超微结构技术，它的任务是研究细胞内各种成分在超微结构水平上的分布情况以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化，以阐明细胞的化学和生化功能。其中最主要的是蛋白质（尤其是酶的细胞内定位），其次是核酸、脂肪、碳水化合物及无机离子的定位。该技术有利的促进了形态学和生物化学的结合，使生命科学的研究进入了新的水平。6 免疫电镜技术 免疫电镜技术是通过特殊的标记方法使抗体与电子致密的标记物相结合，然后利用电镜在超微结构水平上鉴定抗原-抗体的结合反应。在免疫学领域中，这是一种非常有用的实验技术。 7 电镜放射自显影技术 电镜放射自显影技术是一种利用放射性同位素作为标记物对细胞化学物质进行超显微结构的定位、定性或定量研究的技术。这种技术不仅用于对重要的代谢物质进行定位、定性或定量，而且还用于显示抗原-抗体的结合，激素或药物与受体的结合，显示病毒的感染与复制部位等。因此这是一种非常有用的现代生物学技术。8.单分子展层技术：观察核酸分子。9.电镜三维重构技术：电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（主要研究生物大分子空间结构及其相互关系）的主要实验手段。 二、超薄切片的制样步骤（一）、取材方法1动物及人体组织的取材动物组织的取材，应在麻醉（1%戊巴比妥钠按5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污锋利的（双面）刀片将材料切成大约1宽，23长的小块，从中挑选损伤小的小条，再将其切成3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有冷的新鲜固定液的有盖青霉素小瓶里，放入冰箱冷藏室低温固定（）。 2体外培养细胞的取材生长在培养瓶中的体外培养细胞取材时，先倒出培养液，接着到入适量的戊二醛固定液，在冰浴上放置min，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将含有细胞的固定液转移到离心管中，普通离心机低速离心（2000转/min）15min，使细胞聚成团块，弃去上清夜，换上新鲜固定液继续固定。 3 植物组织的取材植物组织的取材比较容易，它的细胞离体后变化不象动物细胞那样迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗透。因此，植物材料的取材宜切成薄片状，经适当固定后再切成小方块。（二）、固定 1.固定的目的和要求 破坏细胞的酶系统，阻止细胞自溶。将细胞的动态系统转变为不可动的、稳固的状态，细胞超微结构尽可能接近生活时的状态。稳定保存细胞物质成分，防止在以后的制备过程抽提或丢失任何成分。提供一定的电子反差2.固定方法（1）浸泡固定:取出组织放入小瓶内固定液浸泡，注意保证组织块沉入固定液中。（2）原位固定:在保持器官血液供应的情况下，边解剖边将固定剂滴加到器官组织上，直至组织适当硬化，才取出组织。（3）血管灌注固定:将固定液通过血液循环的途径灌注到所需的组织中。 3. 固定的条件（1）双固定法:戊二醛先固定，再用锇酸后固定。（2）固定时间:戊二醛固定2h以上，不超过一星期，锇酸固定26h。动物材料固定时间较短，植物材料固定时间较长。（3）固定剂浓度:戊二醛16%，锇酸12%。浓度较低，时间必须延长，容易引起细胞物质的抽提及组织的肿胀，浓度太高易损坏细胞的微细结构。（4）固定温度：一般于04冰箱中固定。低温能降低酶活性，减少细胞自溶和物质抽提，但低温对某些结构有害，如：微管、微丝。(三) 清洗 每一种固定液固定之后，都要用配置该固定液的缓冲液充分漂洗，除去多余的固定液，防止戊二醛与锇酸反应，致使锇酸固定能力减弱，避免固定剂与后面的脱水剂反应，产生沉淀，影响固定效果。 （四）脱水 用适当的有机溶剂取代组织细胞中的游离水。1.脱水的作用（1）使包埋剂能均匀地渗入到组织细胞的各部分。因为包埋剂不溶于水，组织中的水分，影响包埋剂的渗透。（2）提高样品反差，水的成分和组成生物的成分差别很小，散射电子的能力低，带水的样反差低。（3）避免因水分的存在使细胞在电镜高真空状态下急 聚收缩而遭破坏。 2.脱水剂的种类 一般是既能与水相溶又能与包埋剂相混合的有机溶剂，如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、环氧丙烷等。常用的脱水剂为乙醇和丙酮。3.脱水的方法 在原固定瓶中，将脱水剂（乙醇）配制成系列浓度，30%、50%、70%、90%、100%（重复3 次），由低到高，逐级脱水，每级间隔 5 15 min。植物脱水时间宜长，动物脱水时间宜短。4.脱水过程中的注意事项 脱水要彻底，无水乙醇或丙酮一定不能含有水分。在100乙醇或丙酮脱水时，最好用无水硫酸铜或无水氯化钙吸去脱水剂中的水分，确保组织块的彻底脱水。 脱水时间不宜过长，若当天不能完成脱水全过程，样品可在70%脱水剂中过夜，因为在70%的浓度下组织的体积变化最小，切不能在100的浓度中过夜，否则易造成某些细胞成分（如脂类等物质）的抽提加俱，样品发脆，切片困难。 更换液体时动作要迅速，注意不要让样品干燥，否则样品内易产生小气泡，使包埋剂难以渗入。 在脱水过程中，脱水剂的浓度间隔不能太大。（五）渗透与包埋 1、包埋剂的种类及其特点 （1）包埋剂应具备的条件： 包埋剂在单体状态时为液体，粘度要足够低，使其能均匀地渗入组织块中。 聚合前后体积不变。 能耐受电子束轰击，不升华，不变形。 透明度好，在电镜下不显示结构，不影响成像质量。 不抽提改变细胞成分，良好地保存细胞结构。 聚合后有适当的硬度和良好的切割性能。（2）包埋剂种类 环氧树脂是目前常用的包埋剂，这是一种加热后能变硬的含有环氧基团的脂肪族合成树脂。呈淡黄色半液体，它和一定比例的硬化剂、加速剂等混合，在一定温度的作用下形成不可塑的交链的黄棕色的固体。 EPON 812 是目前国内外普遍采用的一种优良的包埋介质，微黄色液体，粘度较低，溶于乙醇和丙酮，不溶于水。a. 配制方法： 成分用量（ml）作用Epon 812DDSAMNADMP-304130.15主体降低硬度增加硬度加速固化b.聚合温度和时间：35 1224h；45 1224h；60 24h。 ERL-4206(又名Spurr):粘稠度低，易渗入致密的组织，但切片反差较低。a.配制方法： 成分用量（ml）作用VCDDERZSADMAE106260.4主体降低硬度硬化剂催化剂b.聚合温度和时间： 70,810h2.渗透和包埋技术（1） 渗透：将材料置入脱水剂与包埋剂的混合液中，脱水剂的比例逐渐减少，包埋剂的比例逐渐增加，用包埋剂逐步取代组织中的脱水剂，使细胞内外所有空隙都被包埋剂填充。 脱水剂:包埋剂 时间(h) 3 :1 13 1 :1 13 1 :3 13 纯包埋剂 812 动物渗透时间短，植物渗透时间长。（2）包埋: 将渗透好的样品放到适当的模具(胶囊、小离心管等）中，灌入包埋剂，经加温聚合，形成固体包埋块，使样品获得坚固的支持，可供切片机切割。（3）包埋方法将样品挑入模具中，往模具中灌满包埋剂，放入标签。在一定的温度和时间内聚合，聚合后，包埋块中的样品位置无法再改变，所以将要切的面朝向模具的顶端。 常规包埋； 夹条包埋； 二次包埋； 浅槽包埋3包埋剂配制过程中应注意的事项 环氧树脂包埋剂易吸湿受潮，所用容器一定要干燥后才能使用，在室内环境湿度较大时，应进行除潮处理。 在搅拌包埋剂混合液时，动作要均匀，尽量防止气泡的产生。 加速剂DMP-30的用量要准确，用量过少会造成聚合不好，过多则使包埋块发脆。 包埋后剩余的包埋剂要密封保存，置冰箱（4）中，第二天仍可继续包埋。 应根据季节温度的不同，改变包埋剂的软硬程度，夏季包埋剂要求偏硬，冬季包埋剂要求偏软。（六）切片1、载网和支持膜（1）载网的选择:电镜中使用的载网有铜网、不锈铜网、镍网等，常用的载网直径为3mm。载网为圆形，网孔的形状有圆形、方形、单孔形等。网孔的数目不等，有100、200、300目等多种规格，可根据需要进行选择。孔大，有效观察面大，支持性差，膜不耐电子束轰击；孔小，有效观察面小，支持性好，膜较耐电子束轰击（见图） 。 （2）铜网清洗 a.可以将铜网浸泡在无水乙醇中待用 b. 用醋酸戊酯浸漂几小时后，再用蒸馏水冲洗数次，然后再将铜网浸泡在无水乙醇中进行脱水。 c.如果铜网经以上方法处理仍不干净时，可用稀释的浓硫酸（1：1）浸12min，或在1% NaOH 溶液中煮沸数分钟，用蒸馏水冲洗数次后，放入无水乙醇中脱水，待用。（3）支持膜载网上覆盖一层膜，用以支持样品。支持膜本身没有结构，薄而透明。有一定的机械强度，能经受电子束的轰击，不与样品发生反应。厚度在20nm以下。 制膜的材料和溶剂有机材料溶剂浓度聚乙烯醇缩甲醛（Formvar） 火棉胶醋酸纤维素氯仿、二氯乙烯、二氧六环乙醚、丙酮等丙酮等0.20.5%0.52.0%0.20.5% Formvar 膜的制备（见图） A用干净的玻片插入0.3% formvar溶液中，静置片刻（时间视所要求的膜的厚度而定，约几秒），取出后垂直放，使多余的溶液流干。玻片在制膜液中静置时间越长，膜越厚。 B用锋利的刀片，沿玻片四周划刻痕，将其缓慢的斜插入培养皿的水中，利用水的表面张力的作用，使膜剥离，漂浮于水面。 C将铜网排列于膜上，用一张稍大于膜面的滤纸覆盖其上，待滤纸刚湿润时，一边轻提滤纸，一边翻面，将贴有铜网的滤纸取出水面，晾干备用。 制膜时的注意事项：a.制膜用的玻板一定要光洁，否则膜不能从玻板上剥落漂浮。b.溶液中不能有水分和杂质，室内相对湿度应在60%以下，否则制出的膜会出现很多微孔及斑点而影响观察。c.膜开始漂浮时，动作要轻巧，手不能发抖，以免使膜发皱。膜出现皱褶不宜使用。d.操作时应防尘、避风、以免尘埃落到膜上或溶液中。2.切片刀制作（1）切片刀的类型：用于超薄切片的刀有不锈钢刀、钻石刀及玻璃刀。 （2）玻璃刀的制作（见图） ：用制刀机把玻璃条裁成正方形的小块，再裁成45斜角制作2把三角形刀，将制作好的玻璃刀，用双筒解剖镜检查，选择刀口平，无锯齿的玻璃刀。（3）刀槽的制作：在玻璃刀的刀口背部用胶带做刀槽，先用胶带粘于玻璃刀口的一侧，胶带顶边与刀口平行，将胶带的另一端粘于玻璃刀口的另一侧，两端的胶带与玻璃刀口的侧面对齐，在胶带和玻璃刀接触的部分，用石蜡密封，以防漏水。 3.修块 （1）修块的目的：除去组织块多余的包埋介质和不需要的组织，使要切的部分硬度一致。（2）修块的方法：将包埋块修整成锥体，锥体顶端面可修整为梯形、正方形或长方形，常修成上边短，下边长的梯形，要求上下边平行，截面平整，才能切出连续的切片带，一般顶端面积为0.05 mm2 0.5 mm2。、切片（1）切片机的类型：切片机根据不同的进刀系统分为两大类，即热膨胀式和机械进刀式。热膨胀式是利用金属杆热胀冷缩产生长度变化的原理来提供进刀切片。切片的厚度取决于加热电流的大小，电流越大，膨胀越大，切片就越厚。（2）切片（生物）的厚度：超薄切片 0.01 0.10m （半薄切片） 0.1 0.2 m普通切片 3.0 8.0 m 厚切片 10.0 25. 0 m（3）超薄切片的操作 装块：把修好的包埋块固定在定向头上，锁住样品臂，必须使组织块的长边成水平放置，并让长边在下方。 装刀：把做好刀槽的玻璃刀安装在刀夹上并固定，刀刃与刀台上可翻出的标志杆等高，根据组织块软硬程度不同,调节刀的间隙角，LKB超薄切片机通常用45。 对刀：使切面的平行边与刀刃平行，切面中心面与刀刃处于同一水平。 进刀：选择好切片的刀刃，先用粗调进刀，再用细调进刀，直到刚好切到片，第一片不超过1m，样品的表面最为珍贵 。 加水：向刀槽内注入蒸馏水，开始可注入过量的水，使液面成凸面，以浸湿刀刃，然后吸回一些液体，使液面成为凹面。 切片：打开自动切片开关进行切片，开始时稍厚，再根据研究要求调节切片的厚度，至切出满意的片子。确定切片的厚度，可以从干涉色来判断，干涉色和切片厚度近似值关系如下： 捞片：镊子夹住铜网，膜面向下沾片。干涉色切片厚度（nm）暗灰色浅白色银白色金黄色紫色4040505070709090nm以上 （六）染色 生物体组织和细胞成分主要是由C、H、O、N等轻元素所组成，它们的原子序数低，对电子散射能力弱，相互之间的差别有很小，所以在电镜下显示出来的图象看不清，即反差偏低，为了增强图象的反差，必须把超薄切片进行染色。 电子染色：利用某些金属元素盐与细胞的某些结构和成分结合，以增加其电子散射能力。进而达到提高反差的能力。1.常用的染色剂 （1）铀 原子序数92，它能与细胞中大多数成分结合，特别对含有DNA的细胞结构有强烈的染色作用。铀是放射性元素，操作中要注意安全。 醋酸双氧铀 UO(CHCOO).2HO,UA）：用戊二醛和锇酸双固定的组织切片，经醋酸双氧铀处理后，反差加强。 a.常用溶度为1%5%醋酸双氧铀水溶液作为染色液。室温下染色30min到1h。 b.12%的醋酸双氧铀乙醇溶液（50%、70%或95%乙醇）作为染色液，这种染色液穿透切片的能力较水溶液好。室温下染色2030min。支持膜用火绵胶时，就不能用。 硝酸铀：硝酸铀比醋酸双氧铀稳定，但没有醋酸双氧铀染色效果好，常用2的70乙醇溶液（2）铅 原子序数82，是最广泛应用的一种电镜染色剂。 铅与含有还原锇的组织结构有较强的亲和力，使细胞的膜结构、核糖体、糖元等着色。 铅易与空气中的CO2发生反应生成碳酸铅沉淀，污染切片，操作时要尽量减少铅染液和空气接触，所用的试剂要新鲜，含CO2少，配置铅染液所用的水要煮沸以除去水中溶解的CO2。 铅染液的配制方法：硝酸铅1.33g、柠檬酸钠1.76g、蒸馏水30ml，溶解后加1mol/L氢氧化钠8ml，加蒸馏水至50ml。2.染色的方法（1）铀染：在一培养皿中放入蜡片，在蜡片上滴一大滴12醋酸双氧铀染色液，铜网切片面朝下飘浮在染液上，染色30 min ，用镍子夹出铜网，依次在3个盛有蒸馏水的小烧杯中漂洗，洗去多余的染液，再用滤纸吸去水分，自然干燥。 （2）铅染：在蜡片的四周放上固体氢氧化钠，将柠檬酸铅染液滴于蜡片中，铜网切片面朝下飘浮在染液上，染色10 15 min ，用镍子夹出铜网，依次在3个盛有蒸馏水的小烧杯中漂洗，洗去多余的染液，再用滤纸吸去水分，自然干燥。3.超薄切片染色常出现效果欠佳的原因有如下几种可能性： （1）标本本身前固定处理不好（如标本体积过大、取材时间过长、取材环境温度过高等）； （2）在后固定时锇酸没有完全渗透固定（主要是标本体积过大所致）； （3）染色液pH值的影响（一般醋酸铀pH为4.5，柠檬酸铅pH为11染色效果较好)。三、染色技术1.正染色（阳性反差染色）：高密度的重金属染色剂和样品的微细结构成分结合，增加样品局部的电子散射能力，使电镜图像反差增强，在荧光屏上形成正像。主要用于超薄切片中的染色。 一般认为电子染色剂是和生物样品的成分以静电力结合，或者是以络合物或复合物的方式结合，金属粒子选择性沉着在特定的部位。 2.负染：利用高密度的重金属染色剂把生物样品包绕，作为衬托，增加背景对电子散射作用，生物样品结构却相对多地通过电子，最终在荧光屏上形成暗背景下的亮像。样品的精细结构的反差得到增强，又叫阴性反差染色。主要用于颗粒状的微小物体，如病毒、离体的细胞及生物大分子蛋白质和核酸等。例如用磷钨酸的钠盐将样品包围，同时染色剂还会进入观察对象的内部，既能显示外部形态，又可在一定程度上反应样品的内部结构。（1）负染样品的制备 用于负染的标本均为悬浮液。 提取材料：提纯、分离、浸出、挤榨 调节浓度：稀释、浓缩（离心、沉淀） 制悬浮液：蒸馏水、缓冲液、生理盐水、乳化剂 分散样品：震荡、超声、允浆（2）负染的操作方法 负染的方法有滴染、漂浮、喷雾等。 将2磷钨酸水溶液滴于蜡盘中； 样品悬浮液滴于蜡盘中，将铜网膜面朝下漂浮在样品悬浮液上，用滤纸吸干余液； 待铜网上的样品即干时，把有样品的铜网膜面朝下漂浮在染液的悬滴上染色12min； 负染后，用滤纸吸干余液，自然晾干。（3）负染色中应注意的问题 pH 值 对效果有较大的影响，一般偏酸的效果好。碱性染液往往造成生物标本的凝聚变形。 适时负染，当用滤纸吸干载网上的样品的液滴，肉眼看不见残液，又未干燥时进行染色，效果最好。 不同的染色时间，效果差异显著。一般是12min.3.超薄切片与负染技术比较超薄切片负染取材制样反差分辨率图像生物原样可定位复杂繁琐易变形较弱较低内部结构提纯的悬浮液不必定位简易，不变形较强较高表面形貌第三节 电子显微镜细胞化学技术电镜细胞化学技术：利用特异的化学反应产物（不溶性电子致密电子沉淀物）来识别和定位细胞内含物。电镜酶细胞化学技术是在光镜细胞化学的基础上发展起来的新的一门技术，到目前为止，能在电镜下定位的酶有100多种，主要通过酶的活性作用结果间接地证明酶的存在。一般先将酶原位固定在细胞内，再使它与特定的底物起反应，底物的分解物经过捕捉反应沉着于发生分解的原位上，最后使沉着物变为在电镜下可以看到的物质。在整个处理过程中必须保存酶的活性不受破坏。目前能在电镜下定位的酶有三大类即水解酶、氧化酶和转移酶。电镜细胞化学技术种类繁多，包括：酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、电子显微镜放射自显影技术、离子细胞化学技术、示踪细胞化学技术及电子显微镜特殊染色技术等。一般来说，在尽量保存细胞超微结构的同时，原位直接将生物化学的反应显示出来，电镜下可辨别，从而将结构与功能的研究直接结合起来。主要用于各种生化物质，尤其是酶的细胞内定位，其次为核酸、脂肪、碳水化合物及某些无机离子的定位。一、电镜酶细胞化学反应的基本原理1.基本原理在一定的组织细胞内存在着某些特定的酶，而各种酶都有各自特定的位置，在一定的反应条件下，使细胞内的酶与底物发生特异性反应，最终在酶的活性部位上产生一种不溶性的电子致密沉淀，用电镜观察辨别确定该种酶在细胞超微结构中所存在的部位及其活性高低。酶与底物反应越特异，越能准确地显示酶的存在及其位置。 （1）水解酶 水解酶可分为五类即磷酸酶类、酯酶类、芳香基硫酸酯酶类、糖苷酶类以及作用于肽腱酶类。水解酶是催化水解反应的酶类，在超微结构水平上显示酶的细胞化学方法都是以孵育阶段为中心，孵育液中一般都有酶的反应底物和捕捉剂。反应的基本原理可分两个步骤： 底物经过酶的分解形成初级反应产物； 初级反应产物和相应的捕捉剂形成一种不溶性的化合物称为最终反应产物，这些最终反应产物是一些不溶性重金属沉淀物（如铅、铜、钡等），在电镜下容易被检出。一般来说，这些沉淀物在细胞的位置就代表了酶促反应的位置。（2）氧化还原酶 氧化还原酶可分为氧化酶和脱氢酶两种。 在氧化酶细胞化学反应中含有两个既分开又紧密联系的底物，一个是生理底物如氧或过氧化氢；另一个是捕捉底物，通常是四盐酸3，3二氨基联苯胺（DAB）。DAB很容易氧化，经过一系列化学变化生成强嗜锇性的聚合物，再经锇酸固定就形成锇黑。脱氢酶常用的捕捉剂为铁氰化物，它在酶的作用下被还原为亚铁氰化物，在铜离子的存在下进一步形成高度不溶性的亚铁氰化铜沉淀。2.基本要求（1）结构保存：如果结构不清晰，不仅难于鉴别正常与异常，而且给细胞化学反应产物的定位带来困难。因此要求组织块要新鲜，并迅速固定。（2）机能保存：保存酶的活性，避免在固定、脱水、孵育等操作过程中，酶扩散和流失。（3）定位保存：细胞化学的最终反应是在细胞特定区域内以不溶性颗粒沉淀。 化学反应尽可能快；要形成不溶性或难溶性沉淀颗粒；颗粒细且要结合牢固不移位，电子密度高。二、方法1.金属盐沉淀 （1）铅沉淀法 酶与特异性底物作用后生成的产物立即被捕获剂铅离子所捕获，使可溶性的酶反应产物迅速转变为不溶性电子致密的沉淀物。 （2）高铁氰化物还原法 用于氧化还原酶类的定位。高铁氰化物作为电子受体，接受由酶作用而游离出来的氢，成为亚铁氰化物，它与捕获剂铜离子作用后，形成不溶性的高电子密度的亚铁氰化物。2.色素法（1）偶氮色素法 用于酯酶、磷酸酶、糖苷酶等活性鉴定。底物在这些酶的作用下，游离出苯酚并与重氮盐结合（偶联），以偶氮色素沉着于酶所在的位置。（2）锇黑法 在色素法的最后一步用锇处理，可提高反差。三、酶细胞化学的常规操作流程 1、固定：常规固定液选取2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液作为固定液，根据不同酶的特性，也可以单独使用其中一种作为固定液。一般固定液需要用缓冲液配置，具体使用何种缓冲液要看具体酶的性质而定。常用的缓冲液有醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液以及二甲砷酸钠缓冲液等。 2、切片：一般采用组织切片机进行切片，厚度在4060m，也可以用冰冻切片机切片。 3、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10min。 4、孵育：孵育是使组织和细胞与某种试剂在特定的条件下充分作用。孵育时必须在使用前配置新鲜孵育液。将切片放入孵育液内，在震荡式恒温水浴箱中孵育，孵育温度一般为3037。如果没有震荡式恒温水浴箱，在孵育过程中，每5min摇晃一次，使孵育液渗透均匀。孵育时间因器官和酶的种类不同而有很大差异（具体时间见各种酶的孵育液的配方及孵育方法）。5、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10min，然后用0.1M二甲砷酸钠缓冲液漂洗3次，每次10min，所用缓冲液要保持在4左右。 6、后固定：可根据需要决定是否用锇酸后固定，一般孵育液中均有重金属。若需要后固定，可用0.1M二甲砷酸钠缓冲液配置的1%锇酸固定1h。 7、脱水、浸透、包埋、切片同常规超薄切片制作，但不必染色。 8、电镜观察：超薄切片经烘干后直接进行电镜观察。如果反差不好，可以进行铅铀双重染色，但必须有不染色的切片对照。第四节 免疫电子显微技术抗原： 能引起抗体产生的外源性物质叫抗原抗体：用抗原物质反复给动物或人体注射后，动物或人体的血浆中即产生某种特异性的蛋白质，这种蛋白质叫抗体。免疫电子显微技术：是通过特殊的标记使抗体与电子致密的标记物相结合，利用电子显微镜在超微结构的水平鉴定抗原-抗体的结合反应。 一 、抗体的标记技术 抗体本身没有电子致密性，因此其散射电子能力很弱，在电镜下不能观察和检测。当抗体与某种电子致密的标记物相结合而形成特殊的标记抗体，就可在电镜下观察到抗体的存在。 1.铁蛋白标记 铁蛋白是一种具有高电子密度的含铁蛋白质，分子内部是一含铁的核心区，铁心外面包有含铁的蛋白质。在电镜下看，呈单个散在的、不透明的圆形颗粒状，很容易辨认。铁蛋白分子可与抗体分子偶联成为标记抗体。2、酶标记 利用酶作标记物，将酶标记在抗体上，形成酶标抗体，在抗原与酶标抗体形成复合物后，再将该复合物与酶底物作用，生成电子致密沉淀物，供电子显微镜观察。3、胶体金标记 用铁蛋白做标记，因其分子量大，穿透能力差；用酶做标记，因其反应会在一定程度上引起样品超微结构的破坏，而影响抗原的准确定位。用重金属粒子（常用胶体金）做标记物，可以克服这些缺点。胶体金是一种带负电荷的疏水溶液，粒子大小1150 nm。因静电作用彼此排斥，使其保持稳定状态。在适当的条件下，胶体金颗粒表面一非共价的静电吸附作用能与多种生物大分子结合，组成胶体金结合物。这种吸附作用不改变被结合的生物大分子的生物学活性。这些生物大分子有免疫球蛋白、植物凝集素，辣根过氧化物酶、蛋白A等。二、胶体金探针的优点 1.反差高，颗粒清晰