基因组学技术在致病基因发现课件

基因组学技术在致病基因发现 1 1基因组学技术在致病基因发现基因组学技术在致病基因发现及临床诊断中的应用及临床诊断中的应用基因组学技术在致病基因发现引言 对疾病的研究一直是人类科研活动的重点和热点之一 人类所有疾病都具有遗传影响和背景，但只有在一少部分疾病中，遗传因素起主要作用 遗传病通常具有先天性、终生性和家族性的特点 2基因组学技术在致病基因发现 遗传病分类遗传病分类 单基因遗传病研究策略回顾单基因遗传病研究策略回顾 复杂疾病研究策略回顾复杂疾病研究策略回顾 应用二代测序技术寻找易感基因应用二代测序技术寻找易感基因3基因组学技术在致病基因发现遗传病分类遗传病分类 单基因遗传病单基因遗传病 多基因遗传病多基因遗传病 染色体疾病染色体疾病 线粒体疾病线粒体疾病 体细胞遗传病体细胞遗传病 4基因组学技术在致病基因发现 权威的在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM），目前已收录的以孟德尔遗传方式为主的遗传病约6700种，其中常染色体连锁的约6200中，性染色体连锁的500种。在这6700多种遗传疾病中，其中已确定其分子遗传基础的单基因病接近3000种，表型已知而致病分子基础未知的约有1830多种。由于单基因病的遗传异质性，还有很多的亚型未被发现。基因组学技术在致病基因发现单基因遗传病单基因遗传病AutosomalX-LinkedY-LinkedMitochondrialTotal* Gene with known sequence12605620483513308 +Gene with known sequence and phenotype3141802334# Phenotype description,molecular basis known27252364282993%Mendelian phenotype or locus, molecular basis unknown1632134501771Other, mainly phenotypes with suspected mendelian basis1831130201963Total191071138596520369OMIM Statistics for May 3, 20116基因组学技术在致病基因发现多基因遗传病多基因遗传病遗传方式复杂，无显性和隐性之分，故也称多因子遗传或复杂疾病。常见的有唇腭裂、先天性下颌前突、高血压、糖尿病、精神分裂症、类风湿性关节炎及先天性心脏病等。复杂疾病的发病率常有地区或族群差异。比如在世界范围内，唇腭裂的发生率约为1/700，拉美、亚洲发生率高，非洲较低。下颌前突亚洲群体发病率较高，大约有8%40%，非洲为3%8%, 欧美较低，约为0.4%4%。7基因组学技术在致病基因发现染色体疾病染色体疾病 数目性染色体畸变数目性染色体畸变 例子如Down综合征，即21三体综合征表型特征有智力低下、伸舌、鼻梁低平、眼裂上斜、小耳、小颌、枕平、内眦敖皮、颈短及肌张力减低等，常伴有先天性心脏发育缺陷 结构性染色体畸变结构性染色体畸变 是在细胞分裂过程中曾有染色体断裂所致。常见的结构异常有缺失、环状染色体、易位、重复、倒位和等臂染色体。如毛细血管扩张性共济失调症 染色体数目异常比结构异常更常见8基因组学技术在致病基因发现疾病致病基因查找研究p疾病致病基因查找 对疾病的诊断与治疗有巨大意义除DNA水平，还有RNA、蛋白、细胞水平等自动化DNA测序仪与微阵列芯片-强有力工具人类基因组计划完成 总体框架传统的基于连锁不平衡（LD）的方法基于家系的Linkage分析基于大样本的Association分析很多成功范例基因组学技术在致病基因发现疾病致病基因定位研究罕见疾病感染率低（318,000 tag SNPs20基因组学技术在致病基因发现数据分析方法数据分析方法 Genome Studio Call rate 99% CNV partition 至少连续5个探针21基因组学技术在致病基因发现数据分析方法数据分析方法 连锁分析 Merlin Genehunter Mendel 单体型分析 Merlin Haplopainter CNV partition22基因组学技术在致病基因发现连锁分析流程连锁分析流程23基因组学技术在致病基因发现参数连锁分析在复杂疾病中的应用参数连锁分析在复杂疾病中的应用在复杂疾病连锁分析中，很多研究倾向于非参数分析，避开对遗传模式的猜测仍有一些学者认为参数连锁在复杂疾病研究中仍然有不可替代的优势在很多研究采用一系列不同的遗传模式，以得到最优遗传模式参数最好结合参数和非参数分析的结果，二者吻合度到，共同支持的连锁区域更可信。24基因组学技术在致病基因发现参数连锁分析在复杂疾病中的应用参数连锁分析在复杂疾病中的应用双致病位点连锁分析在定位到两个或多个候选区域的复杂疾病家系研究中，具有重要意义双致病位点模式可以提高复杂疾病连锁信号的检测效能。这种方法已在多项复杂疾病如家族性高胆固醇血症、静脉血栓栓塞和双相情感障碍研究中成功运用。双区域连锁分析数值高于与单个区域连锁值提示遗传因素相互影响是客观存在的。而这种优势越明显，则越支持两个区域的相互作用。25基因组学技术在致病基因发现CNVCNV与疾病与疾病CNV不仅在基因组中广泛存在，而且在基因富集区尤为突出。大量研究已证实CNV是某些复杂疾病的易感因素，与人类的一些复杂性状，如个体之间的感官差异（包括嗅觉、听觉、味觉和视觉）也有关系。目前已知多种复杂疾病与特定基因的CNV有着明确关系。目前，关于基因组内CNV与疾病的相关性仍处在广泛的研究中，可以肯定的是，其中高频拷贝数变异区域往往在减数分裂时产生重排，导致发育异常类疾病。26基因组学技术在致病基因发现总体结论总体结论基于类似孟德尔遗传的大家系（患者大于10例，至少3代），采用SNP芯片连锁分析是定位复杂疾病易感基因的有效方法之一。双致病位点连锁分析在定位到两个或多个候选区域的复杂疾病家系研究中，具有重要意义。27基因组学技术在致病基因发现应用二代测序技术寻找易感基因 外显子组测序 单个病例、病例组、核心家系 全基因组测序 几个病例、癌组织28基因组学技术在致病基因发现应用二代测序技术寻找易感基因随着二代高通量测序技术的成熟，基于家系样本和少量病例样本的全基因组重测序和外显子组重测序在疾病易感基因研究方面开始显现巨大优势。目前，已有数十种疾病通过外显子组重测序成功定位到了新的易感基因及突变，比如恶性黑素瘤、和痉挛性截瘫。全基因组重测序主要是在癌症这样异常复杂的疾病研究中应该更广泛，比在肝癌和乳腺癌。29基因组学技术在致病基因发现外显子捕获测序（WES）技术外显子区域基因组主要功能区至少85%孟德尔遗传疾病突变位点位于外显子域只占全基因组1%区域，数据量小外显子捕获测序多重探针杂交，特异扩增2009 年首次应用于致病基因的筛选Freeman Sheldon syndrome， 4样本样本-MYH3，验证了已有研究结果。，验证了已有研究结果。 （NG S B, Jay Shendure, Nature，2009）2010年科学杂志十大科学突破之一基因组学技术在致病基因发现WESWES筛选疾病致病基因策略筛选目标引起氨基酸变化的未知或已知罕见突变（missense, nonsense, splice SNP, coding Indel）筛选方案疾病遗传模型筛选策略样本常染色体隐性隐性遗传common LOH gene无关个体，家系常染色体显性显性遗传疾病 common mutated gene无关个体，家系高异质性常染色体显性遗传疾病common LOH gene家系，无关个体自发突变（germline）平均0.86 NS-SNP/新生儿（Lynch M, PNAS, 2010）common mutated gene无关个体，父/母/子自发突变（somatic）common mutated gene无关个体（正常组织，患病组织）基因组学技术在致病基因发现WESWES实验方法外显子捕获试剂盒及实验Agilent 公司SureSelect Human All Exon Kit试剂盒（有效覆盖区域 30M）Pair-end文库Illumina Paired-End Genomic DNA Sample Prep Kit (p/n PE-102-1001)试剂盒，平均插入片段长度200测序平台及实验Illumina Hiseq 2000单样本单道（lane），目标测序长度100，循环次数为108次基因组学技术在致病基因发现WESWES数据分析目标：Rare或novel突变，NS/SS/cIndel流程图基因组学技术在致病基因发现WESWES数据分析方法和软件选择依据：1000 Genomes使用软件使用软件原始数据质量评估与过滤 - SolexaQA软件包原始数据定位（Reads Alignment）软件- BWA软件数据校准和重定位 Genome Analysis Toolkit（GATK）突变和插入缺失查找 SamtoolsdbSNP 和1000 Genomes 位点过滤 - 自编Perl 程序 基因注释 自编程序 突变功能评估 - Polyphen-2基因组学技术在致病基因发现突变基因筛选复合杂合突变基因 - 筛选流程基因组学技术在致病基因发现NGSNGS突变查找中的FN和FP问题 NGS突变查找中的存在假阴性和假阳性 未知突变中的FP问题尤难发现解决 方法应用及检验：新算法，后续大样品SNP验证基因组学技术在致病基因发现NGSNGS突变查找中的FN和FP问题FN主要与测序覆盖度有关FP主要来自系统偏差和数据处理偏差系统偏差：454单碱基重复引起插入缺失；Solexa/SOLiD累计误差数据分析偏差：对齐错误，Paralog突变查找软件通常计算整体的FNR和FPR基因组学技术在致病基因发现未知突变中的FP问题发现现象FP在未知突变数据集(NDB)中富集，而已知位点(DB)突变数据中少。估测随机抽取50个候选未知突变，使用Samtools工具观察其序列对齐情况。类型低质量突变比例1/4末端或靠近末端极端单向覆盖Indel错误对齐单碱基重复区疑似FP总数个数35322971342比例70%64%58%14%26%84%基因组学技术在致病基因发现未知突变中的FP问题碱基置换率考察同类型碱基置换（transition）应高于不同类型碱基置换（transversion）。结果：DB突变符合正常情况，NDB突变明显偏离。基因组学技术在致病基因发现未知突变中的FP问题解释1）已发现报导的突变位点数量巨大（24M），个体细胞中可发现的新的突变越来越少。真正突变中大部分是频率较高的已知突变。2）相对于全基因组，已报告位点只占少数（8%），随机假阳性事件大部分发生在非已报导位点。Venter研究Venter团队2008年基于Sanger测序数据的研究（HuRef）表明，相对于db129，至少25%的新突变是假阳性。何况是NGS？基因组学技术在致病基因发现FP对未知致病基因突变查找的影响FP对基于未知致病基因突变查找的影响加大人工负担降低样本利用效率引发假阴性事件样本过多，目标区域覆盖率不足基因组学技术在致病基因发现未知突变中的FP问题分析FP突变有哪些特征，哪些最严重？Solexa：低质量碱基，读序末端，前面有单碱基重复，插入缺失定位紊乱，单向极端覆盖，等等。很难确定硬阈值：界限不清，与设备、试剂有关。基因组学技术在致病基因发现未知突变中的FP问题分析突变碱基重复（VR）JPT数据基因组学技术在致病基因发现应用二代测序技术研究发病机理、开发临检标志物 转录组测序miRNA组测序 甲基化组测序免疫组测序44基因组学技术在致病基因发现白血病相关的三株淋巴细胞系转录白血病相关的三株淋巴细胞系转录组差异表达及组差异表达及microRNA表达调控分析表达调控分析基因组学技术在致病基因发现研究背景研究背景 急性淋巴细胞白血急性淋巴细胞白血病病 急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病以未分化或分化异常的原始幼淋巴细胞在造血组织中恶性增殖为特征，由内源性或外源性致癌物诱发DNA损伤，导致原癌基因突变或过表达以及抑癌基因失活，从而引起的一种恶性血液肿瘤。l 白血病细胞恶性增生活跃l 细胞形态异常l 细胞内多出现空泡l 大量退化细胞出现l 粒系、红系、巨核系细胞明显受抑5基因组学技术在致病基因发现研究背景研究背景（引自Rosenbauer Frank, et al. 2007） 辐射暴露 吸烟 有毒化学物(苯并芘、苯) 化疗 唐氏综合症及其他特定类型遗传疾病 骨髓增生异常综合征及其他特定类型血液病 一型T细胞白血病病毒（HTLV-1）感染 家族病史 白血病病发诱因白血病病发诱因 白血病发生白血病发生3基因组学技术在致病基因发现研究背景研究背景 淋巴系白血病转录组淋巴系白血病转录组StudyPlatformSamples(n)&sourceMain objectiveYeoh et al. (2002)Affymetrix HG_U95Av2360 ALLALL sub-classificationRoss et al. (2002)Affymetrix U133 A&B132 ALLALL sub-classificationIndependent validationvan Delft et al.(2005)Affymetrix U133 ATotal: 10784 ALL20 AML3 unclassified leukemiaDifferential diagnosis of acute leukemiaHaferlach et al. (2005)Affymetrix U133 A&BTotal: 937620 AML152 ALL75 CML45 CLL45 nonleukemiaDifferential diagnosis of acute leukemiaHoffmann et al. (2006)Affymetrix U133 ATraining set: 104 published ALLTest set: 47 additional ALLALL sub-classificationAnderson et al. (2007)Swegene Human 27K RAPTotal: 12187 B-lineage ALL11 T -lineage ALL23 AMLDifferential diagnosis of acute leukemia（引自Staratschek-Jox, et al. 2009）6基因组学技术在致病基因发现研究背景研究背景 淋巴系白血病淋巴系白血病miRNAmiRNAmiRNAmiRNALeukemia Leukemia typetypePatients Patients analyzedanalyzedRegulation Regulation abnormalityabnormalityPutativPutative e targetstargetsmiR-9-1/2/3ALLAdult and childhood patients，CLDown-regulatedNDmiR-10bALLAdult and childhood patients，CLDown-regulatedNDmiR-34(family)ALLAdult and childhood patients sample，CLDown-regulatedNDmiR-124a(family)ALLAdult and childhood patients sample，CLDown-regulatedCDK6,FOXA2miR-128(a/b)ALL;B cellE2A/PBX1,T cell, Pro-B-ALL,ALLAdult and childhood patients PB or BMUp-regulatedUBE2W,BMI-1miR-150ALLPatient PB or BMUp-regulatedDown-regulatedMYBmiR-181a(family)ALL,AML;M1 and M2Patient PB or BMUp-regulatedTCL-1,AKT3miR-222AML, Pre-B-ALLAdult and childhood patients PB or BMUp-regulatedC-KIT（引自Zac Chatterton, et al. 2010）7CL，Cell Line；PB，Peripheral Blood；BM，Bone Marrow；ND，Not Determined基因组学技术在致病基因发现研究目的及意义研究目的及意义通过新一代测序技术对不同淋巴细胞系中基因表达丰度和功能分析，了解淋巴系白血病细胞的转录谱基本特征；不同分化阶段的细胞间相互比较，理解分化相关基因在调节淋巴系多方向分化过程中的重要作用；不同白血病亚型细胞间的比较，了解不同亚型的淋巴细胞白血病之间差异形成的分子基础以及各自关键的调控因素；从基因转录和转录后调控的角度分析白血病相关的淋巴细胞间基因表达谱差异形成的主要原因，并为临床诊断、治疗及药物研发提供一定的理论基础。Cell Line 1Cell Line 2Cell Line 3mRNAmiRNAExpressionRegulationNetworkDiagnosisDifferentiationDrug designTherapy10Lymphoblastic cell linesDiverse differential periodsLeukemia related基因组学技术在致病基因发现材料与方法材料与方法 实验取样实验取样n RS4;11 来源于32岁急性B淋巴前体细胞白血病女性病患的骨髓；n Jurkat 来源于14岁急性T细胞白血病男性病患的外周血；n GM 来源于正常女性静脉血，经EBV转染后永生化的B淋巴细胞。细胞系细胞系RS4;11JurkatGM样本制备样本制备复苏后，悬浮培养细胞系；Trizol方法提取Total RNA；Ribo-minus方法提取mRNAmRNA-seq；Flash-page切胶18-30bp的片段miRNA-seq。12基因组学技术在致病基因发现材料与方法材料与方法 整合分析策略整合分析策略mRNA数据miRNA数据差异表达分析基因功能分类代谢途径富集差异表达分析新miRNA预测靶基因预测数据整合分析数据整合分析DEGWEGOKEGGDEGRNA foldRNAhybridMirandaTarget ScanmiRNA功能预测构建调控网络实验验证实验验证临床应用临床应用17GO KEGGIPA基因组学技术在致病基因发现结果与讨论结果与讨论 总体差异比较总体差异比较1共表达基因聚类分析特异性表达基因功能分类25基因组学技术在致病基因发现结果与讨论结果与讨论 白血病细胞差异白血病细胞差异2OncogeneRS4;11JurkatGMSPI111.030.047.84RHOB10.811.900.31RUNX23.840.100.35AFF128.454.773.96MYC49.6676.0932.86VAV37.1823.531.69TET10.144.540.36ECT25.9123.49.82CCND10.012.781.50LCK6.41130.932.37FOS0.200.773.06IRF415.840.0390.93KLF64.475.1325.52NFkB22.812.3317.84原癌基因表达聚类29基因组学技术在致病基因发现结果与讨论结果与讨论 B细胞分化差异细胞分化差异2细胞迁移33GM特异表达上调8倍以上上调2-8倍上调1-2倍下调1-2倍下调2-8倍下调8倍以上RS4;11特异表达无显著差异基因组学技术在致病基因发现结果与讨论结果与讨论 白血病细胞差异白血病细胞差异3NOD样受体信号通路30上调2-8倍上调1-2倍下调1-2倍下调2-8倍下调8倍以上RS4;11特异表达无显著差异基因组学技术在致病基因发现结果与讨论结果与讨论 免疫表型差异免疫表型差异2B细胞受体信号通路35Jurkat特异表达上调8倍以上上调2-8倍上调1-2倍下调1-2倍下调2-8倍下调8倍以上GM特异表达无显著差异基因组学技术在致病基因发现结果与讨论结果与讨论 小结小结2两株白血病细胞具有更相似的基因表达谱，并且在Jurkat细胞中表现出更多上调基因。几乎所有趋化因子在白血病细胞中表达都受到抑制，而CXCR4的异常表达可能与其行使细胞免疫功能和细胞迁移的触发作用相关。不同亚型的白血病细胞拥有各自的原癌基因表达谱，两株癌细胞可能参与不同的细胞凋亡途径。PU.1、EBF、PAX5等基因在B淋巴细胞早期分化中扮演重要角色，而IRF基因家族主要在B淋巴细胞成熟后的分化过程中起作用。细胞免疫相关蛋白及其辅助受体在Jurkat细胞中特异性表达，而体液免疫相关蛋白及其辅助受体在GM细胞中表现为显著性上调。37基因组学技术在致病基因发现结果与讨论结果与讨论 miRNA表达表达Reads infoRS4;11JurkatGM No. of total reads191595901959393818167158No. of reliable reads175967301886370617154256Percentage of reliable reads91.8496.2794.42No. of matched miRNA in miRBase729559657No. of expressed known miRNA 297307314No. of total reads matched to miRBase541021840042474050459Percentage of reads matched to miRBase30.7521.2323.61No. of predicted novel miRNA242210206No. of expressed novel miRNA1108497No. of total reads support novel miRNA1299723897489571Percentage of reads support novel miRNA0.740.210.52数据注释结果miRNA表达分布miRNA表达数量统计39（571）基因组学技术在致病基因发现结果与讨论结果与讨论 miRNA聚聚类类miRNA表达聚类40基因组学技术在致病基因发现结果与讨论结果与讨论 miRNA差异比差异比较较HigherLowerFold Change5-1010-5050RS4;11Jurkat, GMmir-320b, mir-1292, mir-222, mir-195, let-7c, mir-122, mir-1277-3p, mir-671-5pmir-125b, mir-519d, mir-3666, mir-148b mir-199b-3p, mir-4458, mir-30aJurkatRS4;11, GMmir-223, mir-1278, mir-95, mir-9, let-7bmir-766, mir-181d, mir-92b, mir-363NAGMRS4;11, Jurkatmir-193b, mir-223*, mir-146b-5pmir-138-5p, mir-21, mir-15b-5pmir-193b*, mir-155miRNA显著上调比较miRNA表达上下调分析RS4;11Exp.JurkatExp.GMExp.mir-422a8.27mir-140-3p8.57mir-39271.64mir-423-5p6.98mir-29c-3p1.96mir-320b6.45特异性高表达miRNALower expressionRS4;11JurkatGMHigher expressionRS4;117290Jurkat72110GM485841基因组学技术在致病基因发现结果与讨论结果与讨论 白血病调控网络白血病调控网络造血系统分化与白血病发生相关基因调控网络42细胞增殖、凋亡与白血病发生相关基因调控网络基因组学技术在致病基因发现结果与讨论结果与讨论 调控网络预测调控网络预测1ETS1BMI1RAB23RAB9bMYBRELBIRF4NFkB2RELFLI1cell cycle inhibitorcell deathsignal transductionregulation of hematopoiesisabnormal proliferation triggerapoptosisFOSMAFKcell survival and proliferationdifferentiationmembrane traffickingdifferentiationproliferation and differentiationblood coagulationAP1proliferationdifferentiationapoptosis白血病发生白血病发生43基因组学技术在致病基因发现结果与讨论结果与讨论 细胞分化调控网络细胞分化调控网络B44基因组学技术在致病基因发现结果与讨论结果与讨论 调控网络预测调控网络预测2B B细胞分化细胞分化Blimp-1PAX5PU.1LEF1ID2NOTCHNOTCH1NOTCH2CD19LMO2ERGRUNX1RUNX345基因组学技术在致病基因发现结果与讨论结果与讨论 小结小结3在三株淋巴系细胞中检测到约15%左右的已知miRNA表达，其中80%以上表现为低或极低表达，在三株细胞中均表达的miRNA有103个。miRNA表达谱聚类结果与转录组一致，白血病细胞之间更为相似且拥有更多上调的miRNA。造血系统分化及白血病发生的过程由多个miRNA同时调控，这些miRNA在特定时期的上、下调影响了转录表达谱的改变。46基因组学技术在致病基因发现总结与展望总结与展望 总结总结48基因组学技术在致病基因发现Summary Justin M. Longa, 2012基因组学技术在致病基因发现个体化医疗个体化医疗核心实验室核心实验室n疾病导向标志疾病导向标志 ( (癌症，心脏病，癌症，心脏病，) ) n药物基因筛检药物基因筛检n疾病风险评估疾病风险评估. . 预防医学预防医学医师医师, ,病人病人, ,健康人健康人R&DR&D治疗治疗 1 2 3 4 1 2 3 4 5 5 ( (药物药物, , 其他其他) )CLIACLIA认证认证组织组织DNADNARNA,RNA,OthersOthers生物标志生物标志 分子影像分子影像其他检测方法其他检测方法基因诊断与个体化医疗基因组学技术在致病基因发现ComplexityDNARNAProtein高通量系统与癌症标记AA BB ABGenomeEpigenomeTranscriptomemethylationExpression genechip and Expression genechip and microRNA arraymicroRNA arraySNP, aCGH chips & NGSSNP, aCGH chips & NGSMass spectrometryMass spectrometryMethylation chipMethylation chipMetabolyteProteomeMetabolomicsNew Generation Sequencing基因组学技术在致病基因发现7171肺癌发展过程肺癌发展过程 与与 癌症标记研发癌症标记研发 Herbst RS, N Eng J Med 2008 PredispositionCancer riskPrognosis and Prediction基因组学技术在致病基因发现肺癌发展史与个体化医疗肺癌发展史与个体化医疗时间诊断点诊断点高危险族群低危险族群癌症临床指标基因组学技术在致病基因发现7373基因与小基因与小RNARNA之预后标记之预后标记mRNA and microRNA Prognostic mRNA and microRNA Prognostic SignaturesSignatures基因组学技术在致病基因发现7474Classification by Multiple Biomarkersp 0.001Low Risk Signature n = 31High Risk Signature n = 32p 0.001Low Risk Signature n = 31High Risk Signature n = 32 Risk ScoreRisk GeneProtective Gene-2.32.3Jjijjigb1ScoreRisk Risk score = =0.47NF1+0.51HGF+0.52HMMR+ 0.52IRF4+0.55ZNF264+0.55ERBB3+0.59STAT2+0.59CPEB4+0.65RNF4+0.75DUSP6+0.92MMD+1.32DLG2-1.09ANXA5-0.84LCK-0.77FRAP1-0.58STAT1nWeighting value: Weighting value: coefficient of Cox coefficient of Cox regressionregressionnSummarize the minor Summarize the minor effects of multiple effects of multiple genesgenesChen HY, N Eng J Med 2007基因组学技术在致病基因发现7575Methods (all stage)Hazard ratioP-valueCPEreferenceMemorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSK) test set (n=104)A2.520.0000.671Shedden et al., Nat Med, 2008B4.050.0000.706I3.210.0000.6705-gene signature3.140.0000.670Chen et al., NEJM, 200716-gene signature2.510.0000.660L1.80.0100.610Potti et al., NEJM, 2006M3.90.0000.710N2.590.0000.680Dana-Farber Cancer Institute (CAN/DF) test set (n=82)A6.680.0000.762Shedden et al., Nat Med, 2008B3.110.0000.690I3.850.0000.7005-gene signature4.000.0000.740Chen et al., NEJM, 200716-gene signature3.640.0000.720L3.370.0100.710Potti et al., NEJM, 2006M2.210.0000.660N1.160.5000.540Hazard ratio was adjusted by age, sex, and Hazard ratio was adjusted by age, sex, and stagestageCPE: concordance probability estimate, refer to prediction CPE: concordance probability estimate, refer to prediction accuracy accuracy Shedden & Beer, Nat Med, 2008Gene signatures and clinical variables in two test sets with all stageFewest genes Fewest genes Fewest genes Fewest genes 基因组学技术在致病基因发现Biogenesis of microRNAmiRNA geneTranscriptionRNAPolymerase IIPri-miRNACap(A)nCroppingDrosha-DGCR8(Microprocessor)Pre-miRNAExportin 5NucleusCytoplasmDicerAgo2TRBPStrand selectionMature miRNAIn RISC基因组学技术在致病基因发现Base-pairing with the target mRNACap(A)nmRNA CleavageNear perfect machCap(A)n3UTRPartial matchTranslational Repression mRNA decaymiRNAmiRNA的功能的功能nPost-transcriptional gene silencingPost-transcriptional gene silencingnEach miRNA regulates hundreds of target mRNAsEach miRNA regulates hundreds of target mRNAsn30% of protein coding genes are regulated by miRNA30% of protein coding genes are regulated by miRNAnControl diverse pathways: development, Control diverse pathways: development, differentiation, metabolism, proliferation, differentiation, metabolism, proliferation, apoptosis, tumorigenesis, metastasisapoptosis, tumorigenesis, metastasis基因组学技术在致病基因发现7878miRNA预后标记预测病患存活率 (Yu SL, Cancer Cell 2008)miR-137miR-137miR-182miR-182* *miR-372miR-372miR-miR-221221let-7alet-7a基因组学技术在致病基因发现7979Low riskN=31High riskN=16All N=47Overall survivalLow riskN=15High riskN=13All N=28Low riskN=12High riskN=25All N=37MonthsMonthsMonthsRelapse-free survivalMonthsMonthsMonthsLow riskN=31High riskN=16All N=47Low riskN=15High riskN=13All N=28Low riskN=12High riskN=25All N=37P =0.044P =0.047P =0.004P =0.031P =0.046P =0.076Stage IStage IIStage IIIStage-subgroup Analysis基因组学技术在致病基因发现8080基因与miRNA之预后标记基因组学技术在致病基因发现8181个体化医疗个体化医疗: :表皮生长因子受体表皮生长因子受体EGFR epidermal growth factor receptorEGFR epidermal growth factor receptor定性定性 vs vs 定量定量基因组学技术在致病基因发现东西方肺癌成因的差异性东西方肺癌成因的差异性 白种人亚洲人EGFR(10%)KRAS(30%)ERBB2(10%)MET(10%)Unknown(Others)EML4-ALKEGFR(30-40%)KRAS(5%)ERBB2(10%)MET(10%)Unknown(Others)EML4-ALK基因组学技术在致病基因发现8383东亚的肺癌个人化医疗东亚的肺癌个人化医疗Personalized Therapy of Lung Cancer in East Personalized Therapy of Lung Cancer in East AsiaAsiaLung CancerGene Testing (Reference Lab)EGFRKRASHER2BRAFEML4-ALKGefitnibErlotinibBIBW2992Sorafenib(?)ChemotherapyTrastuzumabBIBW2992Sorafenib(?) PF02341066METMet inhibitorARQ-197?30%10%5%5%5%510%NTUCGM 2011基因组学技术在致病基因发现8484DNA质谱仪检测EGFR突变Primers for PCR reaction to amply interested regionProbes for specific wild-type/mutation allele detectionStarting template (sample)AmplificationFinal products with different mass by single nucleotide extensionAnalysis by MALDI-TOF MS基因组学技术在致病基因发现85858585质谱仪与直接测序的比较4040484842425959Unpublished data基因组学技术在致病基因发现EGFR T790MEGFR T790M的定量的定量Su KY, unpublished data基因组学技术在致病基因发现87878787二代测序验证DNA质谱仪EGFR基因检测Unpublished data基因组学技术在致病基因发现88888888T790M突变 与 无病存活率的关系Unpublished data基因组学技术在致病基因发现肺癌基因拷贝数的分析肺癌基因拷贝数的分析基因组学技术在致病基因发现基因拷贝数变化基因拷贝数变化 与与 EGFREGFR突变突变基因组学技术在致病基因发现17 gain/loss genes plus 6 control genes17 gain/loss genes plus 6 control genes基因拷贝数变化基因拷贝数变化 与与 病人存活率病人存活率EGRF EGRF 突变突变EGRF EGRF 无突变无突变基因组学技术在致病基因发现9292基因拷贝数变化基因拷贝数变化 与与 标靶治疗之疗效标靶治疗之疗效基因组学技术在致病基因发现JCO Aug 1 Online专利申请专利申请美国专利美国专利 US1975-2011.7.4：METHOD FOR PREDICTING RESPONSE OR PROGNOSIS OF LUNG ADENOCARCINOMA WITH EGFR-ACTIVATING MUTATIONS 世界专利：申请中世界专利：申请中基因组学技术在致病基因发现基因检测实验室基因检测实验室 基因组学技术在致病基因发现退件退件复查复查退件退件复查复查流程Final ReportFinal ReportPathologistPathologistReference LabReference Lab医院收集检体及上传临床资料、医院收集检体及上传临床资料、( (病理学报告病理学报告(HE stain(HE stain的图片的图片)HospitalHospital复查复查EGFR typingEGFR typingGood QualityGood QualityBad QualityBad QualityCheck DNA&RNA QualityCheck DNA&RNA QualityLung CancerLung CancerandandHigh-tumor cell High-tumor cell contentcontentH&E stain (H&E stain (非必要，除非医院没非必要，除非医院没上传上传实验室收到检体实验室收到检体Non-Lung CancerNon-Lung CancerororLow-tumor cell Low-tumor cell contentcontentConfirm cell typeConfirm cell type基因组学技术在致病基因发现9696EGFR EGFR 基因检测基因检测第一线筛选Clamp第二线验证DNA 质谱仪ADx-ARMS依医师要求 直接测序基因组学技术在致病基因发现实验室端：分配实验流程工作、确认实验程序流畅度、掌握时效性医院端：申请帐户、使用说明及谘询、疑难解决、检体配送掌控 报告处理及资料分析：确认实验数据及资料正确性处理联机报告发送事宜联系沟通及谘询服务基因组学技术在致病基因发现肺癌标靶治疗的策略肺癌标靶治疗的策略 ScreeningEarly detectionDiagnosisstagingInoperableOperableRisk genes, SNPs, othersRisk genes, SNPs, othersLD Spiral CT, Smart LD Spiral CT, Smart imaging, etcimaging, etcNew staging system :TNMCNew staging system :TNMCMicrometastasisMicrometastasisnPredict OutcomePredict Outcome and Metastasis and MetastasisnChemopreventionChemopreventionnClinical trialClinical trialnPredict ChemotherapyPredict Chemotherapy Response (ERCC1, RRM1) Response (ERCC1, RRM1)nTarget therapy (EGFR)Target therapy (EGFR)nClinical trialClinical trialClinical networkBiomarkersNew methodsGene, miRNA Biomarkers基因组学技术在致病基因发现Thanks for attention!