毕业设计（论文）松萝茶有机茶园3、12、15号基地鲜叶茶氨酸含量测定

黄山学院 生命与环境科学学院 学士学位论文 本科毕业论文（设计）( 2015届 ) 题 目：松萝茶有机茶园3、12、15号基地鲜叶茶氨酸含量测定 （纸层析法） 测定层析法 学 院：生命与环境科学学院 专 业：生物科学 学生姓名： 学号： 指导教师： 职称（学位）： 研究员 合作导师： 职称（学位）： 完成时间： 2015年 月 日 成 绩： 综合成绩： 等级： 黄山学院教务处制 学位论文原创性声明兹呈交的学位论文，是本人在指导老师指导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。声明人（签名）： 2015年 月 日 第 9 页 共 13 页目 录摘要英文摘要1引言11.1松萝茶简介11.2松萝茶有机茶园地理环境11.3茶氨酸特性 12材料和方法22.1仪器与试剂22.2材料32.2方法32.3实验前准备32.3.1试剂配制32.3.2实验样品处理32.4层析32.4.1准备层析纸32.4.2层析步骤42.5数据处理43结果43.13、12、15号基地地理位置43.2茶氨酸标准溶液数据及标准曲线53.3松萝茶鲜叶茶氨酸含量53.4不同基地松萝茶鲜叶中茶氨酸占干重的比值64讨论74.1纸层析发的优点及不足74.2松萝茶中茶氨酸含量7参考文献8致谢8 松萝茶有机茶园3、12、15号基地鲜叶茶氨酸含量测定层析法 刘峰 ( 21109041029 )导师：吴卫国（研究员）（黄山学院生命与环境科学学院）摘要：本文采用纸层析法对采自安徽省休宁县境内3、12、15号松萝茶基地的松萝茶进行鲜叶的茶氨酸含量测定分析。结果表明，3、12、15号基地的松萝茶鲜叶茶氨酸含量占干茶的1.35%-2.97%，而不同地理位置的松萝茶中茶氨酸含量有一定的差异性。关键词：松萝茶；茶氨酸；纸层析法The Comparative Study of Theanine in Tea From Base 3, Base 12 and Base 15 Organic Songluo Tea Garden (Paper Chromatography) Feng LIU (21109041029) Supervisor: Wei-gou WU(Research Fellow) (College of Life and Environment sciences, Huangshan University, Huangshan, 245041 China)Abstract: In this study, the content of theanine in Songluo Tea has been analyzed by paper chromatography in base 3, base 12 and base 15 organic tea garden from Xiuning county of Anhui province. The results indicated that the fresh content of those two kinds Songluo Tea occupied 1.35%-2.97% of dry teas. The content of theanine in Songluo Tea were different where the Songluo Tea were grown in the difference geographical position.Key Word: Songluo Tea; Theanine; paper chromatograp1 引言1.1 松萝茶简介松萝茶属绿茶类，为历史名茶，创于明初。松萝茶因山名而得茶名，产于黄山市休宁县境内的松萝山，属黄山余脉。松萝茶的采制技术，早在四五百年前已达到精湛娴熟的程度，它具有色绿、香高、味浓等特点。松萝山也被誉为中国炒青茶发祥地。2012年1月，国家质检总局批准对松萝茶实施地理标志产品保护。松萝茶的品质特点是：条索紧卷匀壮、叶张肥嫩，呈波纹隆起，叶背遍布洁白茸毛色泽绿润；汤色绿明、香气高爽、滋味浓厚，带有橄榄香味。饮后令人神驰心怡，古人有“松萝香气盖龙井”之赞辞。松萝茶含有较多的营养成分和药效成分，每百克松萝茶中，维生素c 的含量达170 毫克，果胶3.16%；碳水化合物3.92%，咖啡碱4.05%；多酚类27.39%，此外还含有丰富的亮氨酸、苯丙氨酸、茶氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸等17 种氨基酸，以及矿物元素等有机化合物，人称“绿色之金子”。有抗癌症，抗衰老，助消化，利尿，防辐射，减肥，提神，解渴的作用。1.2 松萝茶有机茶园地理环境松萝茶有机茶园位于安徽休宁城北约15公里的松萝山，松萝山与琅源山、天宝山、金佛山相望，最高峰海拔882米，茶园多分布在海拔600700米之间，山势险峻，崖悬壁峭，松萝交映，连绵数里，风景秀丽，“松萝雪齐”为休宁海阳八景之一。山上气候温和，常年云雾弥漫，雨量充沛，土壤肥沃，土层深厚。得天独厚的小气候环境和含有银元素的乌砂土质为培植品质优良的名茶创造了特定的条件。1.3 茶氨酸特性1949年，日本学者酒户弥二郎首次发现并提取茶叶中的茶氨酸。茶叶中的茶氨酸属酰胺类化合物，易溶于水，性质稳定，本身有焦糖的香味及鲜爽味（味阈值为0.06%）（帅玉英，2008）。 此后有研究证明，茶氨酸是茶叶中的主要呈味物，其含量与绿茶的品质呈正相关（李炎，1998）。氨基酸是具有氨基和羧基的有机化合物，是组成蛋白质的基本单位，它参与生物体内的新陈代谢和生理过程。茶叶中的氨基酸，不仅是决定茶汤滋味的主要成分，而且与茶叶的品质有一定的相关性。茶叶中的氨基酸超过25 种，茶氨酸是茶叶中游离氨基酸的主体部分，不同等级和不同品种的茶叶，茶氨酸都占茶叶游离氨基酸的50% 以上，约占茶叶干重的1%2%。它是1950 年由日本学者酒户弥二郎从绿茶中分离并命名的，属酰胺类化合物(N- 乙基-r- 谷氨酰胺)，极易溶于水，具有焦糖的香味和类似味精的鲜爽味，对绿茶滋味具有重要作用(李银花等，2005)。茶氨酸还能缓解茶的苦涩味，并增强其甜味，是茶叶品质的重要评价因子之一（朱小兰等，2003）。文献中关于茶氨酸测定的研究统计显示，茶氨酸的测定方法包括电化学分析法、纸层析和薄层色谱法、气相色谱法、离子交换色谱法、毛细管电泳法和高效液相色谱法等。高效液相色谱法是目前使用较多的一种氨基酸分析方法。1986 年，朱衍报道采用高效液相色谱法测定茶叶中的茶氨酸。在一定条件下用纯品茶氨酸作标准曲线，在线性范围内，根据峰高或峰面积即可换算出茶叶中茶氨酸的含量。朱小兰等（2003）建立了一种非衍生化高效液相色谱法测定茶叶中茶氨酸含量的方法。采用的色谱条件为C18 柱，以0.05% 三氟乙酸水溶液为流动相，流速1.0ml/min，进样量10l，检测波长203nm，同时以高效液相色谱- 电喷雾离子化质谱对所分离的茶氨酸进行了纯度鉴定（谭和平等，2007）。茶叶中的多酚类及其衍生物、氨基酸、维生素、咖啡碱等成分对松萝茶的风味、品质及其功效有较明显的影响。其中，又以茶叶中的特征氨基酸茶氨酸关系最为密切。在已发现的30多种氨基酸中，以茶氨酸的含量最高，约占到茶叶中游离氨基酸的总量的50%以上（吕毅，2003）。 本文以安徽休宁县不同地理位置的松萝茶基地的松萝茶为研究对象，采用纸层析法进行茶氨酸的检测分析，旨在筛选出高茶氨酸品种，同时对不同区域间茶氨酸含量进行分析，了解不同区域间松萝茶的茶氨酸含量差异，提取茶氨酸生物源提供依据。2 材料与方法2.1 仪器与试剂（1）仪器：分析天平(AB204N梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司)、分光光度计(721型, 上海第三仪器分析厂)、电热恒温水浴锅(HH.S 21-6V型, 上海医疗器械五厂)、电热恒温干燥箱(SZ202-1型, 浙江诸暨电热仪器厂)、4000r/min离心机、GPS、冰箱、吹风机。（2）试剂：L-茶氨酸(含量99%)(上海源聚生物科技有限公司), L-谷氨酸(上海展云化工有限公司)，分析纯无水乙醇,水合茚三酮(95.0%)，氯化亚锡，蒸馏水。2.2 材料松萝有机茶园3、12、15号基地的松萝茶鲜叶，采摘标准为一芽两叶。2.3 实验前准备2.3.1 试剂配制茶氨酸标准溶液（1ml含茶氨酸0.1mg）：准确称取100mg L-茶氨酸，溶于100ml水中，充分溶解后，准确吸取5ml母液，加蒸馏水稀释十倍得到茶氨酸标准溶液。展层剂：精确量取无水乙醇75ml，加蒸馏水定容至100ml，取10ml2%茚三酮溶液，用75%的乙醇定容至100ml得到展层剂。2%茚三酮：准确称量0.2000g的水合茚三酮，加入5ml蒸馏水使其充分溶解。随后加入0.008g氯化亚锡，用玻璃棒搅拌均匀，放在暗处，静置24小时后过滤定容至10ml。最后将其存于棕色容量瓶，放置在低温暗处保存。洗脱剂：精确量取无水乙醇60ml，加蒸馏水定容至100ml，即得到60%的乙醇洗脱剂。2.3.2 实验样品处理鲜叶预处理：将装有鲜叶的烧杯放入60电热恒温干燥箱中烘干，直至恒重。将烘干后的茶叶研磨至粉末状，装袋密封后放入冰箱冷藏。样品浸提：精确称取1g（精确度为0.0001g）茶叶粉末于烧杯中，加蒸馏水60ml，将烧杯置于100恒温水浴锅中浸提45分钟，期间每10分钟摇晃搅拌一次。水浴充分后，待其冷却至常温，4000r/min离心5min。将上清液过滤，并定容至100ml，混匀后放入冰箱冷藏。2.4 层析2.4.1 准备层析纸：将层析滤纸剪裁成20cm20cm大小，在距层析纸下沿1.5cm处画一横线，每隔2cm做一标记，分别编号为1、2、3、4、5、6，标记处即点样处。从横线开始向上15cm处画一横线，作为层析停止标记。将直径15cm的培养皿放在平铺的保鲜膜上，加入50ml的展层剂，将2000ml的烧杯倒置于培养皿上方，用保鲜膜密封，保持水平。2.4.2 层析步骤点样：用20ul毛细滴管吸取茶氨酸标准溶液在标记处进行点样，每点一次即用吹风机吹干，待完全干燥后再继续点样。重复操作。吹风机温度不宜过高，每滴样液直径在0.5cm以内。在1-6标记处点样品20ul、30ul、40ul、50ul、60ul、70ul。干燥：点样完成后，待其完全干燥后，将层析纸沿横线弯曲用棉线连接（两条边勿接触）卷成筒状，将滤纸垂直放入装有层析液的培养皿中，扣上烧杯，立即密封好。展层：等展层剂渗入到停止标记处，约3h后，取出层析完成后的层析滤纸，挂在60恒温干燥箱干燥10min。干燥后，取出观察层析情况(烘干后的层析纸上以茶氨酸的显色带最为明显)。水浴：将茶氨酸的显色带以1.5cm1.5cm正方形规格裁下，将其剪碎后放入试管，随后依次加入5ml洗脱剂，并立马盖上塞子（防止洗脱剂挥发），摇匀后放入40的水浴锅中20min。水浴后取出试管冷却至常温，待测。测定：在已预热好的722N分光光度计570nm处，以空白对照为参照物，依次测出样品的吸光值。2.5 数据处理所有数据处理均运用Microsoft Excel 2007统计软件进行数据分析。3 结果3.1 3、12、15号基地地理位置3号基地位于山上有机茶园内，12号基地位于山边公路旁，15号基地位于山上，经纬度及海拔见表3-1。表3-1 3、12、15号基地经纬度及海拔松萝茶基地3号12号15号经度1185.291185.2781188.402纬度300.362957.642953.414海拔（m）3002772983.2 茶氨酸标准溶液数据及标准曲线 对茶氨酸标准溶液进行纸层析，测定以茶氨酸标样的吸光度值（表3-2），以测得的茶氨酸标样吸光度值对质量做出茶氨酸的标准曲线，得到线性方程，如图3-1。 表3-2 茶氨酸标准溶液纸层析OD值体积/ul203040506070质量（mg）0.0020.0030.0040.0050.0060.007OD值0.0070.0180.0250.0340.0460.061 注：横坐标x为OD值，纵坐标y为标液体积。图3-1 茶氨酸标准曲线3.3 松萝茶鲜叶茶氨酸含量实验所用松萝茶样液均为现配现用，且与茶氨酸标准液是在同一时间同一地点进行。将松萝茶3、12、15号基地松萝茶样液分别上述的步骤进行实验，得到松萝茶鲜叶的吸光值，如表3-3、3-4、3-5所示。表3-3 3号基地松萝茶茶氨酸含量点样量(ul)203040506070OD值0.013000.018000.025000.030000.033000.04000茶氨酸质量（mg）0.002710.003190.003850.004330.004610.00528注：点样量单位：ul，吸光度单位：mAU，茶氨酸量单位：mg。表3-4 12号基地松萝茶茶氨酸含量点样量(ul)203040506070OD值0.01300 0.01800 0.02300 0.02600 0.03300 0.03700 茶氨酸质量（mg）0.00271 0.00319 0.00366 0.00395 0.00461 0.00499 注：点样量单位：ul，吸光度单位：mAU，茶氨酸量单位：mg。表3-5 15号基地松萝茶茶氨酸含量点样量(ul)203040506070OD值0.01400 0.02100 0.02500 0.03400 0.03800 0.04700 茶氨酸质量（mg）0.00281 0.00347 0.00385 0.00471 0.00509 0.00594 注：点样量单位：ul，吸光度单位：mAU，茶氨酸量单位：mg。3. 4 不同基地松萝茶鲜叶中茶氨酸占干重的比值松萝茶茶氨酸含量的比较注：横坐标x为点样量，纵坐标y为茶氨酸量。图3-2 3、12、15号基地松萝茶茶氨酸含量松萝茶茶氨酸占干重比值的比较：表3-5 3、12、15号基地松萝茶中茶氨酸占干重的比值点样量2030405060703号茶氨酸占比0.0135560.015930.01930.021630.0230540.02637912号茶氨酸占比0.014030.0173550.01930.023530.0254290.02970315号茶氨酸占比0.0135560.015930.01830.019730.0230540.024954注：横坐标x为点样量，纵坐标y为茶氨酸量占干重比值。图3-3 3、12、15号基地松萝茶茶氨酸含量占干重比值4 讨论 4.1 纸层析发的优点及不足本实验采用纸层析分离茶样中氨基酸, 和茚三酮反应后用分光光度计比色直接测定茶氨酸含量。由于仅仅包含最终显色时候的一个化学反应,整个过程步骤单纯, 只需要乙醇、茶氨酸、茚三酮等3种化学药品, 因而操作简单, 容易控制。此外, 茚三酮与氨基酸显色在较长时间内保持稳定,可实现多个样品的同时分析, 真正满足普通实验室对茶氨酸测定的需要。然而, 本方法灵敏度不够强, 不适合茶氨酸含量较低样品的测定。此外,在纸层析分离时, 需要将2070 L水溶液不断点到滤纸上的一个点上, 吹干, 花费时间较长。本实验中茶氨酸在层析纸上的条带有明显的拖尾现象。造成这些结果的原因有以下几点：实验重复次数不够、点样过程中某些样点的半径过大、使用吹风机型号不同导致风速温度等不同、个别样液未完全干燥便继续点样等。4.2 松萝茶中茶氨酸含量本实验中采用的材料为采自安徽省休宁县境内的3、12、15号基地松萝茶基地内的松萝茶，属于休宁本地种。茶氨酸主要是谷氨酸和乙胺在根中合成，根部合成的大部分茶氨酸通过树干运送到芽尖贮藏，在日照下转化为儿茶素（赵丹等，2002），3个基地处于同一地点的不同海拔，实验结果有所不同，即12号基地位于山边公路旁，海拔较低，茶氨酸含量较高，而3号、15号基地位于山上，海拔几乎等高。且均较高，茶氨酸含量较低。结果表明茶氨酸含量可能跟高度、日照等外在因素有关，有待进一步进行对比实验证明。参考文献：李银花，刘仲华，黄建安，等高效液相色谱- 蒸发光散射检测器测定茶叶中茶氨酸茶叶科学，2005，25(2)：225-228朱小兰，陈波，等高效液相色谱法测定茶叶中的茶氨酸色谱，2003，21(4)：400-402吕毅，郭雯飞，倪捷儿，杨贤强茶氨酸的生理作用及合成茶叶科学，2003，01：1-5帅玉英，张涛，江波，沐万孟茶氨酸的研究进展食品与发酵工业，2008，11：117-123李炎，陈昕茶氨酸合成与应用广州食品工业科技，1998，03：23-26 赵丹，王朝旭茶氨酸的国内外研究现状食品科学，2002，05：145-147张健，荣绍丰，龚钢明，邱子春不同茶叶中茶氨酸含量的测定比较食品科学，2008，04：335-337岳婕，李丹，杨春，马蕊，奉展英，罗军武不同茶树品种氨基酸组分及含量分析湖南农业科学，2010，23：141-143王小雪，邱隽，宋宇，王朝旭，孙长颢茶氨酸的抗疲劳作用研究中国公共卫生，2002，03：63-65陈宗懋茶氨酸具有降压功能中国茶叶，1997，02：27张莹，杜晓，王孝仕茶叶中茶氨酸研究进展及利用前景食品研究与开发，2007，11：170-174韩海华，周斌星茶氨酸研究及其应用中国茶叶，2009，05：8-10刘小力，李想茶叶中茶氨酸含量的测定方法研究食品科学，2009，14：281-284马雪泷，邹鹏飞，王荡强，曹顺利，房江育，王昶纸层析-分光光度法检测茶氨酸植物生理学报，2012，04：413-417高小红，章小林，袁华分光光度法测定茶叶中的茶氨酸光谱实验室，2005，03：524-526谭和平， 陈丽， 等茶叶中氨基酸的测试方法概述中国测试技术，2007，33(6)： 1-4致谢在即将告别母校的时候。首先感谢我的父母二十余年的抚养，没有他们的辛苦劳累，就没有今天的我，由衷地谢谢我的爸爸妈妈。还有我想衷心的感谢母校四年来对我的培养，大学里，我感受到了人格魅力的伟大，受到了很多渊博思想的熏陶。本文的研究工作是在吴卫国老师的指导下完成的。特别感谢吴老师的指导和大力支持，在做实验及论文纂写时给与了全力支持和帮助，吴老师以其严谨、务实的治学态度，风趣而颇具吸引力的讲课方式，平易近人的工作作风和高度的责任心与敬业精神深刻地感染着并影响着我。感谢吴老师在关键时刻予以点拨指导。感谢吴老师在课下空余时间里为我们解决设计过程中遇到的实际问题。还将大量的书籍提供给我们阅读学习。毕业论文之所以能够顺利完成，与吴老师为我们做的一切是分不开的，也同时感谢祝吴芳、张瑞等同学对我的指导和帮助。特在此设计完成之际，向我的指导教师吴卫国老师表示由衷的感谢。同时感谢大学里的各位老师在四年的时间里的培养，使我能系统的学习专业知识，了解本专业先进知识的动向。