RNA干扰的机理及特点

天水师范学院论文(综述)RNA干扰的机理及特点08生科2班：刘小东 指导教师：赵菲仪（天水师范学院生化学院 甘肃 天水 741001）摘要: RNAi技术是利用双链RNA降解细胞内同源mRNA而使细胞缺失一定的功能的方法;具有高效性、序列特异性、高稳定性等特点。总共有触发物的加工、目标mRNA的结合、目标mRNA的降解三个主要过程；作为一种基因打靶技术，在细胞功能改造、基因治疗、功能基因组学等方面有着重要的作用。【关键词】:RNAi;mRNA;过程; 特点;意义；RNA Interference Mechanisms and CharacteristicsAbstract: RNAi technology is the use of double-stranded RNA degradation of cells homologous mRNA leaving the cells missing some function .It is effective, sequence specificity, high stability and other characteristics. There are the three main processes: the trigger processing; the combination of target mRNA target mRNA degradation.As a gene targeting.It is play an important roles in the transformation in cell function, gene therapy, functional gomics and so on. Key words: RNAi; mRNA; Process; Features; Significance； RNAi( RNA infterence, RNA 干涉或RNA 干扰)技术是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象,利用内源或外源双链小RNA ( double stranded RNA, dsRNA) 高效、特异性地降解细胞内同源mRNA从而关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，使细胞靶基因出现缺失的表型。也是有机体防范病毒或转座子诱导DNA突变的一种生理机制,这种现象发生在转录后水平1, 又称为转录后基因沉默( post transcription-al gene silencing ，PTGS) 。作为近年来兴起的新型分子生物学技术，由于介导了精确的基因沉默，非常适用于阻滞肿瘤细胞或组织中异常或突变蛋白的表达2、或者促进肿瘤细胞衰老的作用3。在细胞功能改造、基因治疗、功能基因组学等方面有着重要的作用，并且越来越受到人们的青睐。自安德鲁.法尔1998年在nature上报到了对线虫注射外源双链RNA可诱发与该RNA高度同源的基因序列的沉默以来。国外先后报道在水蛙、果蝇、斑马鱼、爪蟾及脊椎动物体内发现有类似的现象4 ，在植物的研究中也发现dsRNA可以诱导细胞产生反应,将外源性RNA及与其同源的内源基因转录产物降解,以防止转座元插入或病毒整合到基因组中导致有害基因突变,这也是植物抵御病毒入侵的一种防御机制。而在病毒体内也有类似的机制。近年来， RNAi研究和应用达到了前所未有的新高度从RNAi机制原理、RNAi技术在基因功能研究领域的应用，乃至临床应用等众多领域都有大量突破性成果涌现RNAi已经成为基因功能研究和基因治疗研究等领域的最热门技术之一，仅仅在首次命名RNAi的8年之后，Andrew Fire和Craig Mello因此荣获2006年诺贝尔生理医学奖。 一 、 RNAi的过程 1.触发物的加工研究发现双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)是RNAi的触发物，其有一段非互补的区域将互补的两个区域分开，为了形成一定的结构，非互补区至少含有四个碱基4。通常是细胞感染病毒复制时RNA合成的中间产物及一些DNA病毒两条互补链转录产物相互结合、褪火的副产物2 ；他首先引发与之互补的单链RNA(single-stranded RNA,ssRNA)降解。实验室常用cDNA文库技术以其的用途来构建相应的载体，再经过质粒系统进行筛选和序列分析。2.目标mRNA的结合 在此过程中小分子干扰核糖核酸（short interfering RNA,siRNA）是引物RNA，在此过程中可对目标mRNA起到定位与引导作用。其特征结构为5磷酸基团和3端的羟基，两条链的3末段各有两个碱基突出与末端。而小干扰RNA起作用的关键是双链RNA能与靶mRNA 相互结合。其有两个来源：(1)Dicer酶切 在RNAi反应过程中，dsRNA被核糖核酶-（Dicer 酶）切割为2123个核苷酸长度的siRNA，siRNA再与含有核酸内切酶的核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA induced silence complex，RISC）5。 （2）化学合成 在一般的实验中可以利用人工构建针对目标mRNA的siRNA，利用RNAi设计软件，进行全基因组扫描和序列同源分析，排除那些和其他编码序列同源的序列。再通过化学合成，该法一般在癌基因的研究和功能基因组学方面较为常用。周颖、凌斌等6将靶向EDAG-1基因的特异序列连接到逆转录病毒载体RNAi Ready pSIRENRetroQ中, 通过转染包装病毒细胞, 获得含大量病毒上清液感染白血病细胞株K562, 经过嘌呤霉素的筛选, 选出了抑制EDAG-1基因表达的稳定细胞K562/siRNA。3.目标mRNA的降解上述过程形成的RNA诱导沉默复合体（RNA induced silence complex，RISC）进而识别并与siRNA具有完全互补序列的同源mRNA 结合，并将之降解，从而引起基因沉默或关闭，导致细胞丧失了一定的功能。郭丽萍, 房殿春等7 研究肝癌细胞表明RNAi靶向降低HepG2 肝癌细胞线粒体膜电位,引起Smac（线粒体来源的胱氨酸酶激活剂( second mitochondriac derived activator of caspase, Smac)） , 引起Smac从线粒体释放入胞浆,进而抑制XIAP基因表达,促进caspase3 表达增加诱导细胞凋亡，为研究basonuclin基因在卵母细胞发育早期的功能提供了新的手段。 RNAi机制的模式图（引自何国平 张思仲）二 特点 1.高效性因其在不影响非特异性干扰素途径的情况下可抑制靶基因的表达，效率明显高于传统的反义核酸。同时在降解mRNA的过程中，siRNA作为特殊的引物，在依赖于RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA为模板合成dsRNA，又被降解为新的siRNA重新进入上述循环，起到放大效应。 2.序列特异性因为其是根据相应的靶基因由化学合成或由酶切得到，故它具有特异性和定向性，只针对靶基因的mRNA起作用，而不碍及其他细胞的基因或功能。也有研究揭示了一个蛋白家族RNA解旋酶参与了RNAi的程，在植物中发现dsRNA诱导了同源序列基因组DNA不对称的甲基化也对此过程有一定的影响。李乐军、刘辉等8通过构建G250 shRNA真核表达载体,利用脂质体转染方法,转染到G250表达阳性的Ket r-3 细胞。显示G250 G250 可能在肾癌的发生发展中起着重要调节作用。王宁、王冠军9等研究发现PTTG siRNA对PANC-1细胞的生长有抑制作用，发现转染PTTG siRNA 后的细胞中PTTG 的mRNA转录和蛋白表达均较未转染组明显降低。3、 意义 1.防御病毒的侵染 有研究表明植物的体内存在转录默（PTGS）现象，现已证明这一机制在多种机体内发挥作用，但不包括脊椎动物和类。 2.移动基因沉默从而保证基因组的稳定 他可以使转座子的双链均被转录，从而形成dsRNA，介导RNAi，从而保证基因组的稳定性，也可以通过对染色质进行甲基化修饰，抑制其转录的过程。 3.抑制蛋白合成及调控机体发育 他可通过碱基配对结合mRNA，导致mRNA的降解或翻译的抑制，从而形成具有一定功能缺陷型的生物体，估计在哺乳动物体内含有约500种miRNA，大约有30%的基因被它们调控。 4.提供了一种可操作的工具特异性的抑制基因 RNAi提供了一种可操作的工具特异性的抑制基因，可以广泛用于功能性基因组学的研究中。RNA干扰技术有望成为一种医疗工具，为以后治疗遗传病指明了方向。 作为近年来兴起的新型基因沉默工具, RNAi技术由于他的特点能够迅速而简单地制备某个功能缺失表型,已处于实践应用阶段。尽管取得了一定的成果，但在有些方面还有一些技术瓶颈有待进一步的研究和发展。在未来, RNAi修饰的手段能够修饰基因或改造基因从而使特异表达的基因打开或关闭,改变整体的遗传结构和特征，甚至可组织实现特异基因突变，给癌症的治疗和细胞功能的改变带来了希望和曙光。而且随着时间的推移，在广大科技工作者的努力下，我们有理由坚信，RNAi技术必将造福人类。参考文献： 【1】何国，张思仲.RNA干扰分子机制研究进展.中华医学遗传学杂志.2004年4月第21卷第2期。 【2】刘立青，张黎 . HO-1 活性变化对HIF-1基因表达的影响 .中国现代普通外科进展. 2009年12月第12卷第12期。 【3】张晓伟,秦 薇等. Bmi-1基因对胃癌细胞增殖的影响及机制 .世界华人消化杂志.2009年5月18日; 17(14): 1390-1393。 【4】朱玉贤，李毅等.现代分子生物学.2007年11月第三版. 212-214。 【5】陈爱平，张红玲，宋慧，杨蕊蕊. siRNA对卵巢癌细胞周期及EGFR表达的影响.生物医学工程与临床. 2009年3月第13卷第2 期。 【6】周颖，凌斌，siRNA靶向EDAG-1基因对K562细胞株生长的影响， 中国癌症杂志 2006年第16卷第12期。 【7】马峻，周红林等，外源性双链RNA对小鼠卵母细胞basonuclin基因表达的影响，中国科学C辑，第32卷第3期。 【8】李乐军，刘辉，RNAi沉默G250/MN/CAIX基因对肾癌Ketr-3细胞株生物学行为的影响.现代泌尿生殖肿瘤杂志，2009年6月第1卷第3期。 【9】王宁，王冠军等，小干扰RNA抑制PTTG 基因对人胰腺癌细胞PANC-1侵袭能力的影响，中国实验诊断学，2009年11月第13卷第11期。