资源描述
自然流产绒毛染色体异常与血液中叶酸水平的相关性研究技术报告1、 选项背景 导致自然流产的原因较多，如遗传基因缺陷、母体因素、胎盘内分泌功能不足、环境因素、免疫因素等，有关资料研究显示男女方叶酸缺乏也会导致自然流产。其中遗传基因缺陷导致自然流产时，多为三体、三倍体及X单体等染色体数目异常，其次为断裂、倒置、缺失和易位等染色体结构异常。遗传基因缺陷的胚胎多数结局为自然流产，极少数可能继续发育成胎儿，但出生后也会发生某些功能异常或合并畸形。国外数据表明，孕妇前三个月、中三个月、后三个月自然流产染色体异常率分别为60%、10%-20%、5%-10%。其中较为常见的染色体异常有X单体，发生率约为20%；16号染色体三体，发生率约为16%；18号染色体三体，发生率约为3%；21号染色体三体，发生率约为5%；22号染色体三体，发生率约为5%。通过检测这些自然流产胎儿的常见染色体异常情况，可以为下一代妊娠进行遗传咨询提供资料。如果孕妇自然流产是由于染色体异常引起的，那么下一代有染色体异常的风险较普通人群高；若孕妇下一代为自然怀孕则可选择绒毛或羊水做产前诊断，如果下一胎选择体外受精（in-vitro fertilization,IVF）,则可做胚胎植入前遗传学诊断(Preimplantation Genetic Diagnosis,PGD)。 流产染色体分析目前主要是对流产绒毛进行培养，分析染色体异常的情况，但此项技术比一般羊水培养核型分析困难，在我国只有少数产前诊断中心掌握并能应用，因此大多数产前诊断中心及妇产科没有开展针对流产组织细胞的培养及核型分析检测。荧光原位杂交（FISH）技术是目前国际上比较先进的检测染色体异常的方法，其灵敏度高，所需细胞量少，无需培养，技术容易被掌握。从标本的制备到原位杂交结果分析完成可在48小时内完成，比常规的G-显带染色体核型分析快得多。我们这里FISH测定染色体探针主要针对13、16、18、21、22、X、Y染色体，对于整倍体来说FISH不够全面，所以在取材时同时做快速绒毛检测验证FISH结果。然而，有关自然流产染色体异常与男女双方叶酸含量之间的关系，国内尚未见相关的系统报道。利用FISH检测绒毛染色体，同时检测夫妇双方血清叶酸水平，寻找血清叶酸含量与染色体畸变二者的关系。检测血清叶酸水平含量同时检测叶酸代谢过程中关键酶的编码基因的位点多态性（SNPs），探讨区域性亚甲基四氢叶酸还原酶蛋白编码基因MTHFR和甲硫氨酸合成酶还原酶编码基因MTRR的多态分布与叶酸含量及自然流产的相关性。2、 技术路线（一）、标本类型：流产绒毛（二）、操作流程：【样本玻片制备】试剂耗材：生理盐水、KCL低渗溶液、甲醇、冰醋酸等仪器设备：无菌剪刀或镊子、培养皿、量筒、移液器、塑料吸管、离心管、载玻片、盖玻片、计时器、温度计、水浴锅、显微镜等玻片制备程序：1、取新鲜流产或胎儿组织，用生理盐水洗净。（胎儿组织可以选取肌肉，最好去掉皮肤，避免角质成分的影响）2、无菌剪刀或镊子去掉蜕膜组织，选取绒毛或其他组织，剪碎，该操作可在显微镜下进行。（注意避免母体细胞污染）3、低渗。取标本约3-5mg，加入5 ml 预热至37的0.075M KCl溶液，37低渗20分钟，期间轻轻吹打悬浮细胞12次。4、预固定。缓慢加入2 ml 固定液（甲醇:冰乙酸=3:1），轻轻吹打混匀后1800 rpm，离心10分钟。5、固定。去上清，加入5ml固定液，混匀，期间吹打1次，1800 rpm，离心10分钟。6、固定。重复步骤5。7、消化。去上清，加1ml冰醋酸消化约1分钟，加3ml甲醇终止消化。8、细胞悬液的制备和保存。离心，去上清，根据细胞量加适量固定液混匀后滴片。9、老化玻片。56烤片30min。室温干燥保存。【玻片预处理及变性杂交】试剂耗材：2SSC、0.01M HCL、胃蛋白酶工作液、乙醇等仪器设备：水浴锅、计时器、温度计、镊子、Ep管、PH计、移液器、杂交仪、盖玻片等玻片预处理程序：1、室温下于2XSSC（pH 7.0）溶液中漂洗玻片5 min。2、消化。37下终浓度0.05mg/ml胃蛋白酶工作消化5分钟，可根据实际情况进行调整。3、室温下于2XSSC（pH 7.0）溶液中漂洗5min。4、将玻片依次置于 70%乙醇、85乙醇、100乙醇中各3min脱水，自然干燥。5、探针配制。按照下表中体系进行。名称体积（ul）杂交缓冲液8.0探针2.010.06、离心1-3秒，涡旋混匀后再次短暂离心。7、变性杂交杂交仪变性杂交（自动操作）将10l探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边。杂交仪共变性。共变性条件：75，6分钟，杂交条件：37-42，16小时。8、【玻片洗涤】试剂耗材：0.3%NP-40/0.4xSSC（pH 7.0）、0.1%NP-40/2SSC（pH 7.0）、70乙醇等仪器设备：水浴锅、计时器、温度计等玻片预处理程序：1、移除盖玻片，立即放入67水浴锅0.3%NP-40/0.4xSSC溶液中，漂洗1分钟，振荡1-3秒；2、室温0.1%NP-40/2SSC溶液中，漂洗1分钟，振荡1-3秒；将玻片室温浸泡在70乙醇中，漂洗3分钟，自然干燥。【复染】暗处自然干燥玻片。将15l DAPI复染剂加至目标区域置，立即盖上盖玻片。暗处放置1020分钟后观察。（三）、快速绒毛检测法：将漂洗干净的绒毛放入平皿中，加秋水仙素6-7滴，加1%枸橼酸钠浸泡绒毛；置于37培养箱培养30-40分钟；加入1ml固定液，搅拌混匀；吸出上清液，加入固定液2-3ml，混匀；室温放置，固定15分钟，吸出上清液，加入解离液（甲醇：蒸馏水：冰乙酸=1：2：3）1ml，用小剪刀剪碎绒毛，室温放置10分钟；滴片；75-80烤片2小时，显带染色；核型分析。（四）、抽取男女双方静脉血液（空腹），在贝克曼全自动化学发光仪上测定血清叶酸含量。（五）、MTHFR和MTRR的多态性检测：抽取研究对象EDTA抗凝血2ml，通过Chemagen全自动DNA提取仪进行DNA的提取。运用Primer Premier 5.0和OLIGO 6.0软件进行引物设计分析。MTHFR A1298C基因扩增引物序列(563bp)上游：5-GTTA CATCTACCGT ACCCA-3； 下游：5-AAAGGGAGA AGGGTAAGT-3；MTHFR C677T基因扩增引物序列(328bp) 上游：5 TGG GGT CAG AAG CAT ATC 3下游：5 TTC ACA AAG CGG AAG AAT 3MTRR A66G 基因扩增引物序列(414bp) 上游：5 TTG AGA TTA GTG CTG AAA AC 3下游：5 AAC AAA GAC TAT GTG GTG G 3 图示：Primer Premier 5.0进行引物设计 图示：OLIGO 6.0进行引物设计评价 PCR反应体系25 l包括：10PCR Buffer 2.0 l、dNTPs (各2.5 mmol/L) 2.0 l、MgCl2(25 mmol/L) 1.5 l、上下游引物(20 mo1/L) 各0.5 l、模板DNA(0.3 g/l) 1.0 l、Taq DNA聚合酶(0.5 U/l) 1.25 l、ddH2O 16.75 lMTHFR A1298C PCR反应条件：反应条件为95 5 min，随后进行35个循环的扩增（95 30 s，60 30 s，,72 35 s），72 4min。MTHFR C677T PCR反应条件：反应条件为95 5 min，随后进行35个循环的扩增（95 30 s，55 30 s，,72 25 s），72 4min。MTRR A66G PCR反应条件：反应条件为95 5 min，随后进行35个循环的扩增（95 30 s，58 30 s，,72 30 s），72 4min。（六）、项目主要技术指标完成情况 从2011年7月到2012年6月，共收集100份孕早期自然流产标本及夫妇双方静脉血5ml与100份正常孕早期妊娠妇女夫妇双方静脉血5ml。100例孕早期自然流产夫妇双方中孕30-40天内因胚胎停止发育者75例，40天因胚胎停止发育者25例。所有标本均在医院人流室行手术后取得，绒毛标本盛入装有生理盐水的12ml离心管内并立即送检。静脉血液标本要求在空腹条件下采集，并在2小时内分离血清，-20保存。1、 FISH 检测 取绒毛组织用生理盐水洗净。无菌剪刀或镊子去掉蜕膜组织，选取绒毛剪碎，该操作可在显微镜下进行（注意避免母体细胞污染）。取标本约3-5mg，加入5 ml 预热至37的0.075M KCl溶液，37低渗20分钟，期间轻轻吹打悬浮细胞12次。缓慢加入2 ml 固定液（甲醇:冰乙酸=3:1），轻轻吹打混匀后1800 rpm，离心10分钟。去上清，加入5ml固定液，混匀，期间吹打1次，1800 rpm，离心10分钟。重复固定一次。去上清，加1ml冰醋酸消化约1分钟，加3ml甲醇终止消化。离心，去上清，根据细胞量加适量固定液混匀后滴片，56烤片30min以老化玻片，室温干燥保存。 按FISH检测试剂盒（北京金菩嘉医疗科技有限公司）提供的荧光原位杂交操作说明进行操作。将制备好的玻片进行漂洗、消化、脱水后变性，42杂交16h，洗片、复染后在荧光显微镜下观察、分析杂交信号。2、叶酸含量检测 抽取男女双方静脉血液5ml（空腹），用叶酸检测试剂盒（美国贝克曼库尔特有限公司）在贝克曼全自动化学发光仪上测定含量。3、 结果判读 本实验采用Nikon ECLIPSE 80i型正置荧光显微镜观察，图像由JENOPTIK(ProgRes MFcool)冷CCD采集，以VideoTest-FISH 2.0软件进行分析。每组探针计数至少100个细胞，单独判断每种指标。比较信号大小和强度，两个进行统计的信号之间至少相隔一个相对小信号直径进行区别。重叠的或缺乏明确界线的信号不予统计（如核中荧光信号有分裂、相互交叉或并排的现象，当距离小于信号大小一半时记录为一个信号）。某指标异常细胞比例大于60，结果判读为异常;单个指标异常细胞比例均小于10，结果判读为正常;某种指标异常比例介于10 %-60%之间，加大观测样本细胞数目，如实记录异常细胞比例。 图示：13、21号染色体三体 GLP 13/GLP 21（绿/红） 图示：46，X0 18/CSP X/CSP Y（天蓝/绿/红）4、统计方法： 采用SPSS13.0进行统计分析。叶酸含量等指标以xs表示，多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析（One Way ANOVA）。率间的比较采用2检验。5、 基因引物的设计 引物设计分析运用 Primer Premier 5.0和OLIGO 6.0软件进行。6、结果6.1、FISH检测结果 100例自然流产绒毛组织FISH杂交成功率100 %，染色体数目异常检出率40.0 %（40/100）。40例检出异常的病例中，常见异常类型有常染色体三体占异常发生总数比75.0 %(30/40)，其中16号染色体三体、22号染色体三体和13号染色体三体分别占35.0 %（14/40)、25.0 %（10/40)和 15.0 %（6/40)；X染色体单体占7.5 %（3/40)；三倍体占17.5 %（7/40)。 6.2、绒毛染色体核型分析 对100例病例组标本进行绒毛染色体核型分析，成功98例，2例因细胞克隆少而无法进行显带检测，且耗时较长。6.3、FISH检测结果与绒毛染色体核型分析结果比较 FISH检测结果与染色体核型分析结果比较，符合率达到88.0%【（40+48）/100】。有12例结果不一致，其中10例因FISH探针未涉及的染色体异常引起，2例绒毛染色体核型分析结果为正常而FISH检测为16-三体。两种检测方法的吻合度强（2=59.278,p=0.000），FISH方法诊断流产绒毛染色体数目异常快速、准确、高效。见表1。表1 FISH检测结果与绒毛染色体核型分析结果比较FISH结果核型分析结果合计异常正常异常40242正常104858合计50501006.4、叶酸含量检测结果 病例组男女体内叶酸均低于对照组叶酸含量，差异有统计学意义；经FISH检测核型异常组男女血清叶酸与核型正常组男女血清叶酸含量相比，差异有统计学意义；见表2、3表2 不同组别叶酸含量检测结果组别 性别例数（n）叶酸含量xs（ng/ml）病例组男10011.71.9*女10012.71.3#对照组男10012.22.2女10015.41.8 表3 病例组叶酸含量检测结果组别 性别例数（n）叶酸含量xs（ng/ml）核型异常男4010.62.1女4011.31.7核型正常男6011.41.7女6012.21.5*与对照组男性体内叶酸含量相比，P0.05;#与对照组女性体内叶酸含量相比，P0.05与核型正常组男性体内叶酸含量相比，P0.05;与核型正常组女性体内叶酸含量相比，P0.056.5、叶酸代谢过程中关键酶的编码基因的位点多态性结果 表4结果显示检测117份自然流产史的患者标本，MTHFR C677T中TT基因和MTRRA66G中GG 基因型呈现高分布频率。表4 叶酸代谢过程中关键酶的编码基因的位点多态性结果基因基因型例数(n,%)中国人群基因型频率MTHFR C677TCC19(16.2)22.0%CT54(46.2)50.0%TT44(37.6)28.0%MTHFR A1298CAA98(83.8)66.0%AC19(16.2)31.0%CC0(0.0)3.0%MTRRA66GAA63(53.8)57.1%AG42(35.9)36.6%GG12(10.3)6.3%三、主要研究内容1、建立标准化的自然流产样本处理、质量控制及绒毛FISH检测的操作程序，为临床推广应用奠定基础；2、探讨自然流产中异常染色体核型与叶酸含量之间的关系；3、探讨区域性亚甲基四氢叶酸还原酶蛋白编码基因MTHFR和甲硫氨酸合成酶还原酶编码基因MTRR的多态分布与叶酸含量及自然流产的相关性。四、创新点1、有关自然流产染色体异常与男女双方叶酸含量之间的关系，国内尚未见相关的系统报道。本次研究分析了染色体异常分布频率，对FISH检测绒毛染色体异常的夫妇血清叶酸含量进行检测，寻找血清叶酸含量与染色体畸变之间的关系，是本研究的创新之处。 2、自然流产史患者人群中MTHFR C677T中TT基因和MTRRA66G中GG 基因型呈现高分布频率。关于该基因与妊娠结局及相关机制有待进一步研究。3、检测叶酸代谢过程中关键酶的编码基因的位点多态性（SNPs），并探讨区域性亚甲基四氢叶酸还原酶蛋白编码基因MTHFR和甲硫氨酸合成酶还原酶编码基因MTRR的分布特点，对于个体化指导育龄孕龄妇女叶酸补服水平，进一步降低出生缺陷有重要指导意义。五、保密要点 无六、应用、推广情况 对叶酸代谢过程中关键酶编码基因的位点多态性（SNPs）进行相关检测，对本院育龄及孕龄期妇女进行了个体化指导孕前期、孕早期及中期叶酸补服，达到优生优育。七、存在问题及改进措施 本项目由于样本数较少，一些相关数据没有达到预期结果，有待进一步增加研究样本数，寻找出与染色体畸变发生相关的生化指标。叶酸代谢直接反应叶酸水平，检测叶酸代谢相关基因位点，个体化指导孕前期、孕早期及中期叶酸补服，达到优生优育。 12
展开阅读全文