疫血清学技术PPT课件

免疫血清学技术 用 于 检 测 抗 原 或 抗 体 的 体 外免 疫 反 应 技 术 或 称 免 疫 检 测技 术 ， 这 一 类 技 术 因 一 般 都需 用 血 清 进 行 试 验 ， 通 常 称为 免 疫 血 清 学 反 应 或 免 疫 血清 学 技 术 第四讲 一、凝聚性试验n 抗 原 与 相 应 抗 体 结 合 形 成 复 合 物 ， 在 有 电 解 质存 在 下 ， 相 互 凝 聚 形 成 肉 眼 可 见 的 凝 聚 小 块 或沉 淀 物 ， 根 据 是 否 产 生 凝 聚 现 象 来 判 定 相 应 抗体 或 抗 原 ， 称 为 凝 聚 性 试 验n 根 据 参 与 反 应 的 抗 原 性 质 不 同 ， 分 为 由 颗 粒 性抗 原 参 与 的 凝 集 试 验 和 由 可 溶 性 抗 原 参 与 的 沉淀 试 验 二 大 类 （一）凝集试验n 细 菌 、 红 细 胞 等 颗 粒 性 抗 原 ， 与 相 应 抗 体结 合 ， 在 有 适 当 电 解 质 存 在 下 ， 经 过 一 定时 间 ， 形 成 肉 眼 可 见 的 凝 集 团 块 ， 称 为 凝集 试 验 (agglutination test)。 n 参 与 凝 集 试 验 的 抗 体 主 要 为 IgG、 IgM。n 凝 集 试 验 可 用 于 检 测 抗 原 或 抗 体 。n 凝 集 试 验 可 根 据 抗 原 的 性 质 、 反 应 的 方 式分 为 直 接 凝 集 试 验 （ 简 称 凝 集 试 验 ） 和 间接 凝 集 试 验 。 直 接 凝 集 试 验 n 颗 粒 性 抗 原 与 凝 集 素 直 接 结 合 并 出 现 凝 集现 象 的 试 验 称 作 直 接 凝 集 试 验 (direct agglutination test) n 玻 片 法 ： 定 性 试 验 ， 适 用 于 新 分 离 细 菌 的鉴 定 或 分 型 n 试 管 法 ： 定 量 试 验 ， 检 测 待 测 血 清 中 是 否存 在 相 应 抗 体 和 测 定 抗 体 含 量 间 接 凝 集 试 验n 将 可 溶 性 抗 原 (或 抗 体 )先 吸 附 于 一 种 与 免 疫无 关 的 ， 一 定 大 小 的 不 溶 性 颗 粒 (统 称 为 载体 颗 粒 )的 表 面 ， 然 后 与 相 应 抗 体 (或 抗 原 )作用 ， 在 有 电 解 质 存 在 的 适 宜 条 件 下 ， 所 出现 的 特 异 性 凝 集 反 应 称 为 间 接 凝 集 反 应 。n 敏 感 性 高 ， 但 特 异 性 较 差 可 溶 性 抗 原n 细 菌 、 立 克 次 氏 体 及 病 毒 的 可 溶 性 抗 原n 原 虫 、 吸 虫 、 丝 虫 的 浸 出 液n 动 物 的 可 溶 性 物 质n 激 素 及 各 种 组 织 器 官 浸 出 液n 植 物 性 蛋 白 质 如 花 粉 浸 出 液 等n 某 些 细 菌 的 可 溶 性 多 糖 常 用 的 载 体 颗 粒n 有 红 细 胞 (“ O”型 人 红 细 胞 ， 羊 红细 胞 )、 聚 苯 乙 烯 胶 乳 颗 粒 ，n 白 陶 土 、 离 子 交 换 树 脂 、 火 棉 胶n 致 敏 颗 粒 ： 载 体 吸 附 了 可 溶 性 抗 原 间 接 血 凝 试 验 将 抗 原 致 敏 于 红 细 胞 表 面 ， 用 以 检 测 相 应 抗 体 ，在 与 相 应 抗 体 反 应 时 出 现 肉 眼 可 见 凝 集 ， 称 为 间接 血 凝 试 验 (passive heamagglutination assay, PHA) 将 抗 体 致 敏 于 红 细 胞 表 面 ， 用 以 检 测 检 样 本 中 相应 抗 原 ， 致 敏 红 细 胞 在 与 相 应 抗 原 反 应 时 发 生 凝集 ， 称 为 反 向 间 接 血 凝 试 验 (reverse passive heamagglutination assay, RPHA)。 乳 胶 凝 集 试 验 聚 苯 乙 烯 乳 胶 是 利 用 化 工 原 料 聚 苯 乙 稀 经 过 乳 液 聚 合得 到 的 高 分 子 乳 胶 液 ， 乳 胶 微 球 直 径 约 0.8m。 对 蛋 白 质 、 核 酸 等 高 分 子 物 质 具 有 良 好 的 吸 附 性 能 。 利 用 聚 苯 乙 烯 乳 胶 的 微 球 作 载 体 ， 以 吸 附 某 些 抗 原 (或抗 体 )， 即 能 用 以 检 测 相 应 的 抗 体 (或 抗 原 )， 称 为 乳 胶凝 集 反 应 。 (latex agglutination test) 协 同 凝 集 试 验n 葡 萄 球 菌 A蛋 白 (staphylococal protein A， 简 称 SPA)是大 多 数 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 特 异 性 表 面 抗 原 ， 能 与 多 种哺 乳 动 物 IgG分 子 的 Fc片 结 合 。n SPA与 IgG结 合 后 ， 其 Fab片 暴 露 于 外 ， 并 保 持 其 抗 体活 性 。n 当 此 被 覆 着 特 异 性 抗 体 的 葡 萄 球 菌 与 相 应 的 抗 原 结 合时 ， 就 可 互 相 连 结 引 起 协 同 凝 集 反 应 ， 简 称 COAG。 （ 二 ） 沉 淀 试 验 n 可 溶 性 抗 原 (如 细 菌 的 外 毒 素 、 内 毒 素 、 菌体 裂 解 液 ， 病 毒 的 可 溶 性 抗 原 、 血 清 、 组织 浸 出 液 等 )与 相 应 抗 体 结 合 ， 在 适 量 电 解质 存 在 下 ， 形 成 肉 眼 可 见 的 白 色 沉 淀 ， 称为 沉 淀 试 验 (precipitation test)。 n 抗 原 可 以 是 多 糖 、 蛋 白 质 、 类 脂 等 ， 抗 原 分子 较 小 ， 单 位 体 积 内 所 含 的 量 多 ， 与 抗 体 结合 的 总 面 积 大 ， 故 在 作 定 量 试 验 时 ， 为 了 不使 过 剩 ， 通 常 稀 释 抗 原 ， 并 以 抗 原 稀 释 度 作为 沉 淀 试 验 效 价 。n 参 加 沉 淀 试 验 的 抗 原 称 沉 淀 原 ， 抗 体 称 为 沉淀 素 。 环 状 沉 淀 试 验n 在 小 口 径 试 管 内 先 加 入 已 知 抗 血 清 ， 然 后 小 心 沿 管 壁加 入 待 检 抗 原 于 血 清 表 面 ， 使 之 成 为 分 界 清 晰 的 两 层n 数 分 钟 后 ， 两 层 液 面 交 界 处 出 现 ， 即 为阳 性 反 应 。n 本 法 主 要 用 于 抗 原 的 定 性 试 验 ， 如 炭 疽 病 的 诊 断( )。 试 验 时 出 现 白 色 沉 淀 带 的 最 高 抗 原 稀 释倍 数 ， 即 为 血 清 的 沉 淀 价 。 琼 脂 免 疫 扩 散 试 验n 琼 脂 的 作 用n 抗 原 抗 体 在 琼 脂 凝 胶 中 扩 散 ， 当 二 者 在 比 例适 当 处 相 遇 ， 即 发 生 沉 淀 反 应 ， 形 成 肉 眼 可见 的 沉 淀 带 ， 此 种 反 应 称 为 琼 脂 免 疫 扩 散 ，又 简 称 琼 脂 扩 散 和 免 疫 扩 散 。 单 向 单 扩 散 单 向 双 扩 散 双 向 单 扩 散 双 向 双 扩 散 免 疫 电 泳 技 术n 免 疫 电 泳n 对 流 免 疫 电 泳n 火 箭 免 疫 电 泳 二、标记抗体技术 n 抗 体 、 抗 原 分 子 小 ， 在 含 量 低 时 形 成 的 抗 原抗 体 复 合 物 是 不 可 见 的 。n 将 特 殊 物 质 标 记 在 抗 体 分 子 上 ， 通 过 检 测 标记 分 子 来 显 示 抗 原 抗 体 复 合 物 的 存 在 ， 即 根据 抗 原 抗 体 结 合 的 特 异 性 和 标 记 分 子 的 敏 感性 建 立 的 技 术 ， 称 为 标 记 抗 体 技 术 (labelled antibody technique)。 高 敏 感 性 的 标 记 分 子 n 荧 光 素n 酶 分 子n 放 射 性 同 位 素 荧 光 抗 体 技 术酶 标 抗 体 技 术同 位 素 标 记 技 术 （ 一 ） 荧 光 抗 体 标 记 技 术 n fluorescent-labelled antibody techniquen 是 指 用 荧 光 素 对 抗 体 或 抗 原 进 行 标 记 ， 然后 用 荧 光 显 微 镜 观 察 所 标 记 的 荧 光 以 分 析示 踪 相 应 的 抗 原 或 抗 体 的 方 法 。 荧 光 色 素n 是 能 够 产 生 明 显 荧 光 ， 并 能 作 为 染 料 使 用的 有 机 化 学 物 称 为 荧 光 色 素 或 荧 光 染 料 。n 可 用 于 标 记 的 荧 光 素 有 异 硫 氰 酸 荧 光 素(FITC)、 四 乙 基 罗 丹 明 (RB 200)和 四 甲 基异 硫 氰 酸 罗 丹 明 (TRITC) 染 色 原 理 及 方 法 n FITC含 有 异 硫 氰 基 ， 能 与 IgG分 子 自 由 基结 合 ， 形 成 FITC-IgG复 合 物 ， 且 不 影 响 结合 抗 原 的 能 力 和 特 异 性 ， 因 此 ， 当 荧 光 抗体 与 抗 原 结 合 后 形 成 有 荧 光 性 的 抗 原 抗 体复 合 物n 常 用 直 接 法 与 间 接 法 n 将 SPA标 记 FITC制 成 FITC-SPA （ 二 ） 酶 标 抗 体 技 术n 根 据 抗 原 抗 体 反 应 的 特 异 性 和 酶 催 化 反 应的 高 敏 感 性 而 建 立 起 来 的 免 疫 检 测 技 术 。n 基 本 程 序 ： 标 记 抗 原 抗 体 复 合 物 底 物n 根 据 底 物 溶 液 的 颜 色 反 应 来 判 定 有 无 相 应的 免 疫 反 应 。 颜 色 反 应 的 深 浅 与 标 本 中 相应 抗 体 或 抗 原 的 量 呈 正 比 。 用 于 标 记 的 酶n 用 于 标 记 的 酶 有 辣 根 过 氧 化 物 酶 (Horseradish peroxidase， HRP)、 葡 萄 糖 氧 化 酶 、 碱 性 磷 酸 酶n HRP的 作 用 底 物 为 过 氧 化 氢 ， 催 化 时 可 使 供 氢 体 产 生一 定 颜 色v 邻 苯 二 胺 (OPD)， 显 色 呈 橙 色 ， 492nmv 四 甲 基 联 苯 胺 （ TMB） ， 显 色 呈 蓝 色 ， 450或 650nmv 3， 3 二 氨 基 联 苯 胺 (DAB)。 反 应 后 的 氧 化 型 中 间 体迅 速 聚 合 ， 形 成 不 溶 性 棕 色 吩 嗪 衍 生 物 。 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 (ELISA)n ELISA是 当 前 应 用 最 广 、 发 展 最 快 的 一 项新 技 术 。 其 基 本 过 程 是 将 抗 原 (或 抗 体 )吸附 于 固 相 载 体 ， 在 载 体 上 进 行 免 疫 酶 染 色反 应 ， 底 物 显 色 后 用 肉 眼 或 分 光 光 度 计 判定 结 果 。 ： 聚 苯 乙 烯 微 量 滴 定 板 （ 珠 ） ， 硝 纤 膜 ： 牢 固 的 吸 附 在 载 体 表 面 ， 保 持 免 疫 原 性 可 溶 性 物 质 或 蛋 白 质 抗 原 易 包 被 较 大 的 病 毒 、 细 菌 需 打 碎 或 提 取 抗 原 用 于 包 被 的 抗 原 或 抗 体 需 要 纯 化 包 被 的 蛋 白 质 浓 度 通 常 为 1 10ug/ml 0.1mol/L pH9.6碳 酸 盐 缓 冲 液 包 被 4 过 夜 或 37 2 3h， 4 或 -20 保 存ELISA实 验 中 的 影 响 因 素 ： PBST ELISA的 核 心 是 利 用 抗 原 抗 体 的特 异 性 吸 附 ， 在 固 相 载 体 上 一 层 层 地 叠 加 试验方法主要有以下几种 n BA-ELISA:抗 原 、 待 检 血 清 、 生 物 素 化 的二 抗 、 酶 标 生 物 素n BAB-ELISA:抗 原 、 待 检 血 清 、 生 物 素 化的 二 抗 、 亲 和 素 、 酶 标 生 物 素n ABC-ELISA:抗 原 、 待 检 血 清 、 生 物 素 化的 二 抗 、 酶 标 记 亲 和 素 与 生 物 素 复 合 物n Dot-ELISA 免 疫 组 化 染 色 技 术n 标 本 制 备 和 处 理 ： 组 织 切 片 、 压 片 、 涂 片 、 细 胞盖 片 ； 消 除 内 源 性 过 氧 化 酶n 染 色 ： 间 接 法 、 直 接 法n 显 色n 观 察 （ 三 ） 放 射 免 疫 测 定 （ RIA）n 将 同 位 素 测 量 的 高 度 敏 感 性 和 抗 原 抗 体 反应 的 高 度 特 异 性 结 合 起 来 而 建 立 的 免 疫 分析 技 术n 可 定 量 分 析 ， 也 可 定 性 分 析n 特 异 性 强 、 灵 敏 度 高 、 准 确 性 和 精 密 度 好 三 、 中 和 试 验 n 根 据 抗 体 能 否 中 和 病 毒 的 感 染 性 而 建 立 的免 疫 学 试 验 称 为 中 和 试 验 。n 主 要 用 于 病 毒 感 染 的 血 清 学 诊 断 、 病 毒 分离 株 的 鉴 定 、 不 同 病 毒 株 的 抗 原 关 系 研 究 、疫 苗 免 疫 原 性 的 评 价 、 免 疫 血 清 的 质 量 评价 和 检 测 动 物 血 清 中 的 抗 体 等 。 中 和 试 验 分 为 2种 v固 定 病 毒 稀 释 血 清 法 ： 测 定 病 毒 毒 价 ； 固定 病 毒 稀 释 血 清 接 种 细 胞 或 动 物 ， 计 算 中和 价 v固 定 血 清 稀 释 病 毒 法 ： 固 定 血 清 稀 释 病 毒接 种 细 胞 或 动 物 ， 计 算 LD50， 然 后 计 算 中和 指 数 （ 中 和 组 LD50/对 照 组 LD50） 四、其他检测技术 n 免 疫 转 印 技 术 （ immunoblotting） n 免 疫 沉 淀 （ immunoprecipitation） n 化 学 发 光 免 疫 测 定 （ chemiluminescent immunoassay， CLIA） n 胶 体 金 免 疫 检 测 技 术 免 疫 血 清 学 技 术 的 应 用n 动 物 疫 病 的 诊 断n 微 生 物 的 鉴 定n 免 疫 增 强 药 物 和 疫 苗 研 究n 生 物 活 性 物 质 超 微 定 量