核酸的研究方法

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,15,章,核酸的研究方法,Nucleic Acid,制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用,一、核酸的分离、提纯和定量测定,真核,DNA,以核蛋白（,DNP,）,形式存在，,DNP,溶于水或高盐溶液（,1mol/L,NaCl,），,但不溶于低盐溶液（,0.14mol/L,NaCl,去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。,DNA,沉淀：,0.3M NaAC-70%,乙醇,（一）,DNA,分离纯化,制备,RNA,时，最重要的是使,RNase,灭活：,所有容器都要经过,高温处理,，不能高温高压的用,0.1,焦碳酸二乙酯（,DEPC,）,处理。,加入,强变性剂,（如胍盐）使,RNase,失活；,在,RNA,的,反应体系内加入,RNase,的,抑制剂,（如,RNasin,),（二）,RNA,的分离,（三）核酸含量的测定,2,、,定糖法,RNA,：,核糖,糠醛,绿色物质（,670-680nm,）,DNA,：,脱氧核糖,+,二苯胺,兰色物质（,595-620nm,）,苔黑酚,/,地衣酚,浓,HCl,浓,硫酸,1,、,紫外吸收法,1,个,A,50g/ml,双链,DNA,40g/ml,RNA,或单链,DNA,3,、,定磷法,核酸含磷量为,9.5%,1g,磷相当于,10.5g,核酸,4,、,琼脂糖凝胶电泳,溴乙锭,能插入,DNA,分子的碱基,对,间形成复合物,在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光,荧光强度与,DNA,含量成正比,纯,DNA,比值,1.8,，,1.8 Pr,、,苯酚污染,纯,RNA,比值,2.0,，,2.0 DNA,、,Pr,、,苯酚污染,（四）、核酸纯度的测定,OD,260,OD,280,二、核酸的沉降特性与超速离心,不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度离心可以将不同构象,DNA,、,RNA,与蛋白质区分开来,8M,CsCl,，,45000rpm,，,16h,密度梯度：,1.80g/ml1.55g/ml,平衡时：浮力密度,=,CsCl,密度,=,离心力,=,0,+4.2,2,（,r,2,-r,0,2,）,10,-10,：,浮力密度,：,角速度（弧度,/,秒）,r,：,样品到转轴的距离,（一）核酸密度的测定,G-C,含量与,DNA,的浮力密度之间呈正比关系,=0.1,x,G,-C,+1.658,x,G,-C,=,（,-1.658,）,10,（二）测定,DNA,的,G-C,含量,RNA,DNA,变性,DNA,双链,DNA,蛋白质，,变性程度越大，浮力密度越大,（三）研究核酸的构象,（,四）用于核酸的制备,超螺旋,DNA,或,用于大片段,DNA,的分离，精度低，但分离范围广。,三、核酸的凝胶电泳,（一）琼脂糖凝胶电泳,用于小片段,DNA,的分析,相对分子质量小于,1000bp,的,DNA,片断和,RNA,的,电泳。,PAGE,中一般不含,RNase,，,用于,RNA,分析时不会分解样品。,（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（,PAGE,）,（一）,DNA,的酶法测定,四、核酸的核苷酸序列测定,英国,Sanger,1955,确定牛胰岛素结构，,1958,获诺贝尔化学奖,1975,设计出,DNA,测序法，,1980,获诺贝尔化学奖,合成一段与待测,DNA,序列互补的,DNA,片段群。,末端终止法,Sanger,2,，,3,双脱氧核苷三磷酸（,ddNTP,）,是,DNA,合成链延伸的,抑制剂,。,MOV:MCB4.0Dideoxy sequencing of DNA,DNA,序列分析仪：,四色荧光基团标记的,dNTP,（,二）,DNA,的化学法测序：,由,Maxam,和,Gilbert,所发明。,其基本原理是用特异的,化学试剂,作用于,DNA,分子中的不同碱基，然后用,哌啶,切断反应碱基的多核苷酸链。用,4,组不同的特异反应，可使末端标记的,DNA,分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱,4,组特异的反应如下：,（,1,）,G,反应：,用硫酸二甲酯,DMS,使鸟嘌呤上的,N,7,原子甲基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断裂,（,2,）,G+A,反应：,用甲酸使,A,和,G,嘌呤环上的,N,原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂,（,3,）,T+C,反应：,用肼使,T,和,C,的,嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基,（,4,）,C,反应：,当有盐存在时，只有,C,与肼反应，并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂,32,P-GCTACGTA,：,在,A,处：,32,P-GCT,和,32,P-GCTACGT,在,G,处：,32,p,，,32,p-GCTAC,在,C,处：,32,P-G,和,32,P-GCTA,在,T,处：,32,P-GC,和,32,P-GCTACG,硫酸二甲酯（,G,）：,*,ACTTCG,*ACTTCGACAG,甲酸（,G+A,）：,*,A,*ACTTCG,*ACTTCGA,*ACTTCGACA,*ACTTCGACAG,肼,/,Nacl,（,C,）：,*,AC,*ACTTC,*ACTTCGA C,*ACTTCGACAG,肼（,C+T,）：,*,AC,*ACT,*ACT T,*ACTTC,*ACTTCGAC,*ACTTCGACAG,从下往上读：,CTACGTA,，,末端,G,不能读出。,32,P*ACTTCGACAG,（,三）,RNA,的测序,RNA,的测序方法有,3,个：,（,1,）用酶特异切断,RNA,链：,（,2,）用化学试剂裂解,RNA,（,3,）逆转录成,cDNA,1995,年,K.Mullis,发明。基本步骤为：,1.,设计一对引物以便有效扩增所需要的,DNA,序列，并尽量减少可能产生的非特异产物,2.,优化反应体系：包括适量模板、引物、,4,种,dNTP,、,Taq,DNA,聚合酶和适量,Mg,2+,五、,DNA,聚合酶链式反应（,PCR,）,3.,选择,3,个温度进行热循环：,变性,94,，,45,60s,；,退火，根据引物的,Tm,，,1min,；,延伸，,72,，,1min,。,循环,4.,扩增完成后取出一定量的反应产物，检测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙啶染色，紫外光下检测结果,y=,产物；,x=,扩增效率；,n,循环次数,(c),(b),引物,2,5,3,3,3,5,5,(,d),新引物,5,3,靶,DNA,的扩增,(a),5,3,引物,1,3,5,3,5,引物,2,互补链,引物,1,互补链,单位长度的链,不同长度的链,5,3,3,5,引物,1,互补链,引物,2,互补链,目的片段（不同长度的链未示出）,聚合酶链式反应示意图,(e),(f),(g),温度（,）,时间（,min,）,94,72,60,94,变性（,1min,）,60,退火（,1min,）,72,延伸,（,1.5min,）,循环,1,循环,2,循环,3,PCR,反应的温度循环周期,如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的,数量满足实验需求为止。,模板,DNA,（,单链）,引物,DNA,聚合酶（,Taq,）,dNTP,Mg,2+,MOV:MCB4.0POLYMERASE CHAIN REACTION,六、,DNA,的化学合成,P521,图,15-6,固相合成法（亚磷酸三酯法）合成,DNA,合成方向：,3 5,端,5-OH,用二对甲氧三苯甲基（,DMT,）,保护。,3-OH,用氨基亚磷酸化合物活化,碱基上氨基用苯甲酸保护,